Бактериологическое исследование

--------------------------------

<33> Клинические рекомендации 2025 - 2026 - 2027.

3.61. Для диагностики ботулизма у больных и при санитарно-эпидемиологических исследованиях продуктов и других объектов окружающей среды проводят бактериологическое исследование для выделения и идентификации возбудителя ботулизма (C. botulinum, C. argentinense, C. baratii или C. butyricum) и (или) типирование микроорганизмов с целью определения токсина и его типов в рвотных массах/промывных водах желудка и в других видах материалов (рисунок 1, таблица 7) <34>.

--------------------------------

<34> Клинические рекомендации - Ботулизм у детей - 2024 (30.09.2024) - Утверждены Минздравом Российской Федерации (далее - Ботулизм у детей - 2024); ГОСТ 10444.7-86.

Клостридии являются облигатными анаэробами, важным условием, которое соблюдают на всех этапах выделения и идентификации анаэробов, является защита этих микробов от токсического действия молекулярного кислорода. Время между взятием материала и его посевом на питательные среды должно быть максимально коротким, важно не допускать сильного перемешивания образца перед тестированием, чтобы не увеличивать содержание в нем кислорода. Разведение образцов проводят в свежеприготовленных растворах с минимально возможным содержанием кислорода. Посевы следует как можно быстрее инкубировать в анаэробных условиях. При наличии анаэробных станций все манипуляции с образцами проводят в них, следуя инструкции по эксплуатации.

Для создания анаэробных условий используют анаэростаты с газовой смесью для культивирования анаэробов, которая состоит из 80% азота, 10% водорода и 10% углекислого газа. Такой состав создается либо механически за счет удаления (откачивания) воздуха из анаэростата и последующего заполнения газовой смесью, либо химическим способом при использовании специальных газогенерирующих пакетов. Активация газогенерирующих пакетов происходит в соответствии с инструкцией производителя.

При работе с жидкими и полужидкими средами анаэробные бактерии культивируют только на специальных бескислородных средах с низким окислительно-восстановительным потенциалом (10 - 150 мВ), содержащих редуцирующие вещества. Для поддержания низкого окислительно-восстановительного потенциала такие среды разливают в пробирки или флаконы высоким столбиком (высотой примерно 10 см). В качестве редуцирующих веществ используют кусочки животных тканей (печень, мозг, почки, селезенка), которые связывают растворенный в среде кислород и адсорбируют бактерии. Основной среди них является среда Китта-Тароцци - жидкая или полужидкая среда, содержащая в своем составе печень, мясо или рыбу (англ. Cooked Meat Medium). Для выделения облигатных анаэробов широко используются питательные среды, содержащие такие восстановители, как тиогликолят натрия, цистеина гидрохлорид, сульфит натрия, дитиотреитол и дитионит натрия. Для контроля за степенью насыщения кислородом в состав питательных сред добавляют специальные редокс-индикаторы (метиленовый синий, резазурин). Примером питательной среды, содержащей восстановители и индикатор, может служить используемая для проведения испытаний на стерильность тиогликолевая среда, которая обеспечивает рост как аэробных, так и облигатных анаэробных микроорганизмов.

Таблица 7

Схема посева пищевых продуктов на питательные среды

для выделения C. botulinum

При бактериологическом исследовании материала от больных на ботулизм, а также продуктов питания и других объектов окружающей среды используют среды обогащения (например, среду Китта-Тароцци) и плотные питательные среды. Плотные среды готовят с добавлением антибиотиков (для подавления сопутствующих микроорганизмов), а также желточной эмульсии (для выявления липазной активности у C. botulinum) или крови.

Лецитиназа, характерная для C. botulinum типов C и D расщепляет лецитин, образуя нерастворимый непрозрачный осадок в среде, окружающей рост. Липаза, наиболее характерная для C. botulinum (типы A, B, C, D, E, F) расщепляет свободные жиры в яичном желтке, в результате чего поверхность колоний приобретает радужный (жемчужный) блеск. Исключение составляют представители C. botulinum типа G (C. argentinense типа G), у которых отсутствует липазная активность. Другие представители группы: C. butyricum и C. baratii не обладают ни лецитиназной, ни липазной активностью.

На средах с бараньей кровью у многих штаммов C. botulinum выявляют , который вызван выработкой ботулинолизина. Однако существует много штаммов, которые не продуцируют этот токсин, и не проявляют гемолитической активности в среде с кровяным агаром.

В работе могут быть использованы среды, предназначенные для выявления клостридий по сульфитредуцирующему признаку, на которых C. botulinum при глубинном посеве формируют черные колонии, а при поверхностном посеве центр колоний может быть окрашен в черный цвет. Перечень питательных сред, возможных к применению при диагностике ботулизма приведен в приложении 2 к настоящим МУ.

3.62. Каждую навеску, приготовленную для бактериологического исследования по п. 3.31, высевают по 0,1 - 0,2 мл на плотные питательные среды и на среды обогащения (в соотношении 1:9). Количество засеянных питательных сред всех наименований рассчитывают с учетом инкубации в анаэробных условиях при двух температурах: плюс (30 +/- 1) °C и плюс (36 +/- 1) °C.

Если в исследуемом материале возбудители ботулизма находятся преимущественно в вегетативной форме, то рост возможен, главным образом, из необработанных образцов. В случае, если в материале имеются споровые формы, то вероятнее получить рост из обработанных образцов, и в отдельных случаях сразу выделить чистую культуры. После посева все исходные образцы проб следует сохранять до окончания исследования в холодильнике при температуре плюс (2 - 8) °C.

Для выявления C. botulinum типа E в среду следует добавлять трипсин до конечной концентрации 0,1% (приложение 2 к настоящим МУ).

3.63. Рост возбудителя ботулизма на средах обогащения характеризуется нередко сильным газообразованием и иногда протеолизом кусочков печени или фарша. При исследовании нестерильного в норме клинического материала помутнение среды после инкубации может быть связано с ростом микробов-ассоциантов.

Рост C. botulinum на плотных селективных средах с желточной эмульсией характеризуется образованием выпуклых шероховатых, немного расплывчатых с неровными краями, окруженных узкой "жемчужной" (радужной) зоной (шириной примерно 1 - 2 мм), повторяющей контур колоний. На кровяном агаре C. botulinum формирует серые колонии с неровными краями, полупрозрачные или непрозрачные; чаще с узкой зоной , проявление которого зависит от температуры инкубации.

В случае появления признаков микробного роста на средах обогащения через 24 - 48 часов инкубации производят пересев на плотные среды. При одновременном появлении на плотных средах типичных колоний C. botulinum из одних и тех же образцов клинического материала их пересев не производят.

Со сред обогащения с признаками роста и из колоний, подозрительных или типичных для C. botulinum, готовят препараты для световой микроскопии - "раздавленная" капля и мазки с окраской по Граму для выявления типичных клеток с терминально расположенными спорами овальной формы в виде "теннисной ракетки". В мазках, приготовленных из свежевыросших колоний, выявляют только вегетативные формы - крупные грамположительные палочки с закругленными концами. В мазках, сделанных из колоний, хранившихся на воздухе при комнатной температуре более 6 - 8 часов, и в препаратах "раздавленная капля", хранившихся в течение суток в закрытых чашках Петри, наблюдают клетки со спорами.

3.64. Выросшую культуру идентифицируют по морфологическим и тинкториальным свойствам, ферментативной активности (в том числе с использованием зарегистрированных тест-систем), белкового профиля (высокопроизводительная матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация с времяпролетной масс-спектрометрией (англ. Matrix-Assisted Lazer Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass-Spectrometry, далее - MALDI-ToF MS), методика применения MALDI-TOF MS описана в п. 3.79) и в реакции нейтрализации на мышах с противоботулиническими сыворотками. Результаты высокопроизводительной MALDI-TOF MS сопоставляют с результатами реакции нейтрализации.

3.65. Обнаружение в культуральной жидкости ботулинического токсина или протоксина и клостридиальных клеток указывает на присутствие в посеве токсигенного штамма C. botulinum. Устанавливают тип обнаруженного токсина или протоксина и тем самым тип C. botulinum, присутствующего в посеве. С культуральной жидкостью или культурой, выросшей на плотных средах, ставят реакцию с поливалентной противоботулинической сывороткой типов A, B, C, D, E и F. При получении положительных результатов реакцию нейтрализации ставят с каждой сывороткой раздельно. Если через двое суток во флаконах не обнаружен рост, то необходимо продолжать инкубацию в термостате, а исследование повторить на 4 - 6 - 10 сутки. При обнаружении в исследуемом посеве палочек, типичных по морфологии для C. botulinum, а также ботулинического токсина дается заключение о зараженности исследуемого материала возбудителем ботулизма. Выделение чистой культуры в таком случае не является обязательным.

3.66. Если же в посевах обнаруживают микроорганизмы, по морфологии схожие с C. botulinum, а токсин отсутствует, проводят активацию культуральной жидкости панкреатином или трипсином по описанной ниже методике для обнаружения ботулинического токсина, а также проводят выделение и изучение чистой культуры. Активацию культуральной жидкости перед постановкой реакции нейтрализации с противоботулинической сывороткой проводят только в том случае, если в среду перед высевом не был добавлен трипсин или панкреатин, как это рекомендовано выше.

3.67. Данный метод позволяет подтвердить диагноз через 4 - 5 дней от момента забора материала.