Приложение 2

к МУ 3.1/4.2.4279-26

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ,
ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ПРИ ВЫЯВЛЕНИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ БОТУЛИЗМА

2.1. Для выделения возбудителя ботулизма используют коммерческие питательные среды или среды, приготовленные в лаборатории в соответствии с изложенными ниже требованиями. Приготовление и контроль готовых питательных сред осуществляют в соответствии с документами по стандартизации <77>, а также методическими документами <78>.

--------------------------------

<77> ГОСТ Р 70393-2022 "Изделия медицинские для диагностики in vitro. Приготовление, производство, хранение и испытания питательных сред", введенный приказом Росстандарта от 13.11.2022 N 1132-ст; ГОСТ ISO 11133-2016 "Микробиология пищевых продуктов, кормов для животных и воды. Приготовление, производство, хранение и определение рабочих характеристик питательных сред", введенный приказом Росстандарта от 07.11.2016 N 1605-ст.

<78> МУК 4.2.2316-08 "Методы контроля бактериологических питательных сред", утвержденные руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 18.01.2008.

2.2. Микроорганизмы C. botulinum не обладает особыми питательными потребностями. Для работы со штаммами C. botulinum или материалом, предположительно содержащим C. botulinum, используют жидкие и полужидкие среды обогащения и плотные (агаризованные) питательные среды.

2.3. В качестве сред обогащения используют мясные бульоны, бульоны с кусочки животных тканей (например, среду Китта-Тароцци), тиогликолевую среду или другие среды, содержащие редуцирующие вещества, такие как тиогликолят натрия, цистеина гидрохлорид, сульфит натрия, дитиотреитол и дитионит натрия. Для контроля за степенью насыщения кислородом в состав питательных сред добавляют специальные редокс-индикаторы (метиленовый синий, резазурин).

2.4. В средах типа Китта-Тароцци рост C. botulinum начинается вокруг мясных кусочков в виде помутнения среды, в процессе роста может наблюдаться почернение мяса, газообразование и неприятный запах из-за протеолитического действия микроба.

2.5. Перед использованием жидкие и полужидкие среды, приготовленные заранее, регенерируют в инокуляционных емкостях (пробирках или флаконах) путем прогревания на кипящей водяной бане в течение 20 - 30 минут, если не указано иное.

2.6. Агаризованные среды чаще всего используют с селективными добавками для подавления микробов-ассоциантов, в качестве которых рекомендуют смесь циклосерина (250 мг/л), сульфаметоксазола (76 мг/л) и триметоприма (4 мг/л), сульфадиазин натрия (50,00 мг/л), канамицин сульфат (6 мг/л), полимиксин B сульфат (15,000 ед/л), олеандомицин фосфат (0,25 мг/л), полимиксин B сульфат (5,000 ед/л). Селективные добавки растворяют в 2 мл стерильной дистиллированной воды и вносят одну из них к 500 мл среды, охлажденной предварительно до температуры плюс 45 - 50 °C. После внесения всех необходимых компонентов среду разливают в чашки Петри, после застывания подсушивают.

2.7. Для выявления C. botulinum типа E в среду добавляют трипсин до конечной концентрации 0,1% (или панкреатин). Приготовление раствора трипсина: 1,5 г трипсина растворяют в 100 мл раствора фосфатного буфера с pH 6,0. Раствор трипсина стерилизуют фильтрованием через керамический или мембранный фильтр с размерами пор 0,40 - 0,45 мкм или другой эквивалентный фильтр. Стерильный раствор трипсина вносят в регенерированную и охлажденную питательную среду асептически непосредственно перед использованием из расчета 1 мл раствора трипсина на 15 мл среды. Трипсин применяют для активизации протоксина C. botulinum. Так как для таких исследований требуется трипсин в довольно больших количествах, его можно заменить эквивалентным количеством панкреатина. Кроме того, такие среды можно брать в пробирках с объемом среды 15 - 20 мл. Панкреатин следует готовить в виде 1% раствора, стерилизовать путем фильтрации через керамический или мембранный фильтр с размерами пор 0,40 - 0,45 мкм или другой эквивалентный фильтр и добавлять во флаконы, которые будут инкубировать при температуре плюс 30 °C, из расчета 1 мл 1% раствора панкреатина на 10 мл среды после прогрева при температуре плюс 60 °C 15 минут.

2.8. В работе могут быть использованы среды, предназначенные для выявления клостридий по сульфитредуцирующему признаку, на которых C. botulinum при глубинном посеве формируют черные колонии, а при поверхностном посеве центр колоний может быть окрашен в черный цвет.

2.9. Яично-желточную эмульсию для приготовления плотных сред можно использовать стерильную коммерческую или приготовить в лабораторных условиях. Приготовление яично-желточной эмульсии: свежие куриные яйца моют, ополаскивают холодной водой, замачивают в 3% растворе перекиси водорода на 30 мин, затем обсушивают, опускают в 70% или 80% этиловый спирт и высушивают. Разбивают каждое яйцо, соблюдая правила асептики, в стерильную чашку Петри и отделяют желток от белка. Помещают желтки в стерильную колбу или флакон с 25 мл стерильной дистиллированной воды и тщательно ресуспендируют. Нагревают смесь на водяной бане при температуре плюс (45 +/- 0,5) °C в течение 2 часов, оставляют на 18 - 24 часов при температуре от 0 до плюс 5 °C для того, чтобы сформировался осадок. С соблюдением правил асептики собирают эмульсию над осадком. Эмульсию хранят при температуре плюс (4 +/- 2) °C не более 72 часов. Добавляют к расплавленной и охлажденной до температуры плюс 50 °C среде из расчета 80 мл яично-желточной эмульсии на 1000 мл среды, тщательно перемешивают и разливают по чашкам Петри. Чашки хранят при температуре плюс (4 +/- 2) °C не более 2 суток, перед использованием подсушивают <79>. Применяют для определения способности C. botulinum давать положительную реакцию с яичным желтком.

--------------------------------

<79> ГОСТ 26670-91 "Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов", введенный постановлением Госстандарта СССР от 25.12.1991 N 2117 (далее - ГОСТ 26670-91).

2.10. В средах типа Китта-Тароцци рост C. botulinum начинается вокруг мясных кусочков в виде помутнения среды, в процессе роста может наблюдаться почернение мяса, газообразование и неприятный запах из-за протеолитического действия микроба.

2.11. Плотные питательные среды для выделения и культивирования C. botulinum:

- селективная среда для выделения C. botulinum из пищевых продуктов с дополнительным внесением циклосерина и сульфадиметоксина и триметоприма;

- селективная среда для выделения C. botulinum из пищевых образцов;

- анаэробный лецитин - липазный агар;

- печеночно-глицериновая среда;

- среда для определения и культивирования мезофильных и спорообразующих анаэробов;

- модифицированная среда Вильсона-Блера с дополнительным внесением полимикина сульфата и сульфадиазина натрия;

- среда для определения и культивирования мезофильных и спорообразующих анаэробов;

- глюкозо-триптозный агар с циклосерином;

- триптиказо-соевый агар;

- улучшенная клостридиальная среда (англ. Reinforced clostridial agar, R.C.M.);

- железосульфитный агар (в модификациях 1 - 4) Питательная среда для выявления и подсчета сульфитредуцирующих бактерий, растущих в анаэробных условиях;

- питательная среда для выявления и подсчета сульфитредуцирующих бактерий, растущих в анаэробных условиях с дополнительным внесением желточной эмульсии, циклосерина и сульфаметоксазола и триметоприма;

- перфрингенс агар основа (англ. Perfringens Agar Base, далее - O.P.S.P);

- клостридиальный агар (англ. Clostridial Agar);

- анаэробный агар.

жидкие и полужидкие питательные среды:

- среда Китта-Тароцци;

- среда с кусочками вареного мяса (Cooked Meat Medium);

- питательная среда для контроля стерильности лекарственных средств (тиогликолевая среда);

- тиогликолевая среда с резазурином;

- триптиказо-пептонно-глюкозный дрожжевой бульон;

- триптиказо-пептонно-глюкозный дрожжевой бульон с трипсином, триптиказо-пептонно-глюкозный дрожжевой бульон с циклосерином и др.;

- бульон Хоттингера.

2.12. Ниже приведен перечень питательных сред лабораторного изготовления:

2.12.1. Агар желточный для анаэробов: к 1000 мл дистиллированной воды добавляют 25,0 мл дрожжевого экстракта, 5,0 г триптона или ферментативного гидролизата казеина, 20,0 г пептона, 5,0 г хлористого натрия и 20,0 г агара. Среду нагревают на кипящей водяной бане до расплавления агара, устанавливают pH (6,9 +/- 0,1), разливают во флаконы и стерилизуют при температуре плюс (121 +/- 1) °C в течение 20 минут. Хранят при температуре плюс (4 +/- 2) °C не более 28 суток. Яично-желточную эмульсию добавляют к расплавленной и охлажденной до температуры плюс 50 °C среде из расчета 80 мл яично-желточной эмульсии на 1000 мл среды, тщательно перемешивают и разливают по чашкам Петри, подсушивают. Чашки хранят при температуре плюс (4 +/- 2) °C не более 2 суток.

2.12.2. Агар печеночно-желточный; агар печеночный. Готовят в соответствии с документами по стандартизации <80>. Яично-желточную эмульсию добавляют к расплавленному и охлажденному до температуры плюс 50 °C печеночному агару из расчета 80 мл желточной эмульсии на 1000 мл агара, тщательно перемешивают и разливают по чашкам Петри. Чашки хранят при температуре плюс (4 +/- 2) °C не более 2 суток, перед использованием подсушивают <81>. При отсутствии печеночного агара допускается заменять его мясо-пептонным агаром.

--------------------------------

<80> ГОСТ 10444.1-84 "Методы микробиологического анализа. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе", введенный постановлением Госстандарта СССР от 17.01.84 (далее - ГОСТ 10444.1-84).

<81> ГОСТ 26670-91.

2.12.3. Агар мясо-пептонный готовят в соответствии с инструкцией производителя и в соответствии с документами по стандартизации <82>. Или 10 г пептона и 5 г хлористого натрия добавляют к 1000 мл мясной воды. Устанавливают pH 7,0 - 7,2, кипятят, фильтруют через бумажный фильтр. Стерилизуют при температуре плюс (121 +/- 1) °C в течение 20 минут. При выпадении осадка в мясо-пептонном бульоне его вторично фильтруют с последующей стерилизацией.

--------------------------------

<82> ГОСТ 10444.1-84.

Для приготовления мясо-пептонного агара в 1000 мл мясо-пептонного бульона перед стерилизацией добавляют 15 - 20 г агара и кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения агара. Устанавливают pH 7,0 - 7,2, разливают в пробирки или флаконы и стерилизуют при температуре плюс (121 +/- 1) °C в течение 20 минут.

Применяют для культивирования мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов.

2.12.4. Агар сахарный кровяной по Цейсслеру. Готовят в соответствии с инструкцией производителя и в соответствии с документами по стандартизации <83>.

--------------------------------

<83> ГОСТ 10444.1-84.

2.12.5. Бульон триптиказо-пептонно-глюкозный с дрожжевым экстрактом (англ. Trypticase-peptone-glucose broth with yeast extract, TPGY) и с трипсином (англ. Trypticase-peptone-glucose broth with yeast extract with trypsin, TPGYT): 50,0 г триптического перевара казеина, 5,0 г пептона, 100,0 мл дрожжевого экстракта, 4,0 г глюкозы и 1,0 г тиогликолята натрия добавляют к 900 мл дистиллированной воды, устанавливают pH (7,1 +/- 0,1). Стерилизуют при температуре плюс (121 +/- 1) °C пробирки в течение 10 минут, флаконы - в течение 15 минут. Хранят при комнатной температуре не более 7 суток. Для культивирования C. botulinum тип E, образующих протоксин, перед употреблением к 1000 мл бульона добавляют 60 мл 1,5% раствора трипсина в фосфатном буферном растворе.

2.12.6. Питательный агар с кровью и глюкозой: к 1000 мл деионированной воды добавляют 17,0 г ферментативного пептона, 15 мл дрожжевого экстракта, 5,0 г натрия хлористого, (17,0 +/- 3,0) г агара, 20,0 г глюкозы, устанавливают pH (7,2 +/- 0,2), стерилизуют при температуре плюс (121 +/- 1) °C в течение 20 минут. После стерилизации и охлаждения температуры плюс до 50 °C добавляют 200 мл бараньей крови. Допускается добавление в среду неомицина до конечной концентрации 50 мг/л или циклосерина до 400 мг/л.

2.12.7. Питательный агар с яичным желтком и лактозой: к 1000 мл деионированной воды добавляют 17,0 г ферментативного пептона, 15 мл дрожжевого экстракта, 5,0 г натрия хлористого, (17,0 +/- 3,0) г агара, устанавливают pH (7,2 +/- 0,2), стерилизуют при температуре плюс (121 +/- 1) °C в течение 20 минут. В стерильную расплавленную среду добавляют 20,0 г лактозы, смесь прогревают в течение 30 минут в водяной бане в кипящей воде. После охлаждения до температуры плюс 50 °C добавляют асептически 10 мл 0,4% раствора бромкрезолпурпурного и 100 мл эмульсии яичного желтка.

2.12.8. Среды для определения ферментации углеводов анаэробами.

Основа среды для определения ферментации углеводов анаэробами.

Состав среды в г на 1000 мл дистиллированной воды:

Приготовление: вносят 26,0 г порошка в 500 мл дистиллированной воды до полного растворения частиц. Стерилизуют автоклавированием при 1 атм (плюс 121 °C) в течение 15 минут. Охлаждают до температуры плюс 45 - 50 °C, асептически добавляют 6,25 мл 10% стерильного раствора соответствующего углевода. Тщательно перемешивают, разливают по пробиркам с поплавками.

2.12.9. Для транспортировки биологического материала с возможным содержанием C. botulinum может быть использована Универсальная транспортная система Амиеса (Эймса).

Состав среды в г на 1 л дистиллированной воды:

2.12.10. Улучшенная клостридиальная среда. Применяют для культивирования C. botulinum. Готовят в соответствии с инструкцией производителя и в соответствии с документами по стандартизации <84>.

--------------------------------

<84> ГОСТ 10444.1-84.

2.12.11. O.P.S.P.

Селективная среда для выделения и подсчета C. perfringens в пищевых продуктах и объектах окружающей среды.

Состав среды в г на 1000 мл дистиллированной воды:

Приготовление: размешать 23,25 г/л порошка в 475 мл дистиллированной воды. Стерилизовать автоклавированием при температуре плюс 121 °C в течение 15 минут, охладить до температуры плюс 50 °C и внести яичную эмульсию в объеме 25 мл и соответствующие селективные добавки.

Селективные добавки для Перфрингенс агар основной: D циклосерин - 200,00 мг; Сульфадиазин натрия - 50,00 мг; Канамицин сульфат - 6 мг; Полимиксин B сульфат - 15,000 ед.; Олеандомицин фосфат - 0,25 мг; Полимиксин B сульфат - 5,000 ед. Селективные добавки растворяют в 2 мл стерильной дистиллированной воды и вносят одну из них к 500 мл среды, охлажденной предварительно до температуры плюс 45 - 50 °C.

После внесения всех необходимых компонентов среду разливают в чашки Петри, после застывания подсушивают. После посева наносят второй слой среды для создания анаэробных условий. Для создания второго слоя используют одну из следующих сред:

2.12.12. Клостридиальный агар (англ. Clostridial Agar). Применяют для селективного выделения Clostridium spp. из смешанных культур в клиническом материале.

Состав среды в г на 1000 мл дистиллированной воды:

Приготовление: размешать 46 г порошка в 1000 мл дистиллированной воды. Кипятить до полного растворения частиц. Стерилизовать автоклавированием при 0,9 атм (температура плюс 118 °C) в течение 15 минут. Можно добавить 5% крови барана для улучшения ростовых свойств при выделении клостридий.

2.12.13. Анаэробный агар.

Агар для культивирования анаэробных бактерий, в частности видов Clostridium spp.

Состав среды в г на 1000 мл дистиллированной воды:

Приготовление: размешать 29,0 г порошка в 500 мл дистиллированной воды, кипятить до полного растворения частиц. Стерилизовать автоклавированием при 1 атм (температура плюс 121 °C) в течение 15 минут.

2.12.14. Сульфитный агар (модификация 1).

Состав среды в г на 1000 мл дистиллированной воды:

Приготовление: размешать 28,0 г порошка в 1000 мл дистиллированной воды, прогревать в течение 2 - 3 минут до полного растворения частиц, разливают в пробирки по 10 мл. Стерилизовать автоклавированием при 1 атм (температура плюс 121 °C) в течение 15 минут.

2.12.15. Сульфитный агар (модификация 2).

Состав среды в г на 1000 мл дистиллированной воды:

Приготовление: размешать 33,0 г порошка в 1000 мл дистиллированной воды, прогревать в течение 2 - 3 минут до полного растворения частиц, разливать в пробирки по 10 мл. Стерилизовать автоклавированием при 1 атм (температура плюс 121 °C) в течение 15 минут.

2.12.16. Сульфитный агар (модификация 3).

Состав среды в г на 1000 мл дистиллированной воды:

Приготовление: размешать 46,5 г порошка в 1000 мл дистиллированной воды, прогревать в течение 2 - 3 минут до полного растворения частиц, разливать в пробирки по 10 мл. Стерилизовать автоклавированием при 1 атм (температура плюс 121 °C) в течение 15 минут. Охлаждают до температуры плюс 50 °C и вносят яичную эмульсию в объеме 25 мл и соответствующие селективные добавки.

2.12.17. Сульфитный агар (модификация 4).

Состав среды в г на 1000 мл дистиллированной воды:

Приготовление: размешать 30,0 г порошка в 1000 мл дистиллированной воды, прогревать в течение 2 минут до полного растворения частиц, разливать в пробирки по 10 мл. Стерилизовать автоклавированием при 1 атм (температура плюс 121 °C) в течение 15 минут. Можно внести 0,5 мл крови после охлаждения среды и соответствующую селективную добавку.

2.12.18. Бульон Хоттингера.

Применяют для культивирования C. botulinum. Готовят в соответствии с инструкцией производителя и в соответствии с требованиями <85>.

--------------------------------

<85> ГОСТ 10444.1-84.

2.12.19. Среда с кусочками вареного мяса (англ. Cook Meat Medium).

Применяют для выделения и культивирования C. botulinum.

2.12.20. Среда Китта-Тароцци с углекислым кальцием.

Применяют для выявления и культивирования C. botulinum.

2.12.21. Среда питательная для контроля стерильности.

В состав среды входят: фермент активный гидролизат казеина неглубокой степени расщепления - 15,0 г; витаминный препарат экстракта кормовых дрожжей 5,0 г; натрий хлористый - 6,4 г; глюкоза - 5,0 г; тиогликолят натрия - 0,3 г; цистеина гидрохлорид - 0,75 г; агар - 0,6 г; натрий углекислый - 0,5 - 0,95 г;

Приготовление: размешать 33,0 г сухого порошка в 1000 мл воды, кипятить 2 - 3 минуты при помешивании, фильтровать, разливать во флаконы. Стерилизовать при температуре плюс (121 +/- 1) °C в течение 20 минут. Готовая среда должна иметь pH (7,0 +/- 0,2). Среду хранят при комнатной температуре не более 7 суток. Применяют для культивирования C. botulinum.

2.12.22. Тиогликолевая среда (питательная среда для контроля стерильности сухая).

Состав среды в г на 1000 мл дистиллированной воды:

Приготовление: размешать 30,0 г порошка в 1000 мл дистиллированной воды, прогревать в течение 2 минут до полного растворения частиц, разливать в пробирки по 10 мл. Стерилизовать автоклавированием при 1 атм (температура плюс 121 °C) в течение 15 минут.

Можно внести 0,5 мл крови после охлаждения среды и соответствующую селективную добавку.

2.12.23. Тиогликолиевый бульон с резазурином (используется для детекции анаэробов). Содержит в составе трипказо-соевый экстракт - 15 г, L-цистеин - 0,5 г, декстроза - 5,0 г, натрия хлорид - 2,5 г, натрия тиогликолят - 0,5 г, резазурин - 0,001 г, агар-агар - 0,75 г.

Приготовление: размешать 29,5 г порошка в 1000 мл дистиллированной воды, разлить по пробиркам по 10 мл, стерилизовать автоклавированием 15 минут при температуре плюс 121 °C.

2.12.24. Печеночный бульон (англ. L. Broth)

Состав среды в г на 1000 мл дистиллированной воды:

Приготовление: размешать 64,0 г порошка в 1000 мл дистиллированной воды. Настаивать в течение 15 минут, периодически помешивать. Разливать в пробирки диаметром 10 мм на высоту до 50 мм, чтобы заполнить дно пробирки кусочками печени. Стерилизовать автоклавированием при 0,7 атм (температура плюс 115 °C) в течение 20 минут. Остужать, засевать пробирки и "запечатывать" их стерильным 2% агаром. Можно внести 0,5 мл крови после охлаждения среды и соответствующую селективную добавку.

2.12.25 Бульон для выделения клостридий дифференциальный усиленный (Differential Reinforced Clostridial Broth (DRCM).

Состав среды в г на 1000 мл дистиллированной воды:

Приготовление: размешать 27,5 г среды в 1000 мл дистиллированной воды. Тщательно перемешивать и кипятить в течение 1 минуты до полного растворения. Разливать в соответствующую посуду и стерилизовать автоклавированием при температуре плюс 121 °C в течение 15 минут. Готовая среда имеет красно-коричневый цвет и хранить при температуре плюс 2 - 8 °C.

2.12.26. Модифицированная среда Дункана-Стронга (Duncan Strong, DS). Данная среда рекомендована для дифференциации C. perfringens от других видов Clostridium spp. при обследовании пищевых продуктов на основе ферментации раффинозы.

Состав среды в г на 1000 мл дистиллированной воды:

Приготовление: размешать 34,0 г порошка в 1000 мл дистиллированной воды до полного растворения частиц. Стерилизовать автоклавированием при 1 атм (температура плюс 121 °C) в течение 15 минут. Разливать по стерильным пробиркам, предварительно проверив pH среды.

2.12.27. Среды для определения ферментации углеводов анаэробами. Основа среды для определения ферментации углеводов анаэробами.

Состав среды в г на 1000 мл дистиллированной воды:

Приготовление: размешать 26,0 г порошка в 500 мл дистиллированной воды до полного растворения частиц. Стерилизовать автоклавированием при 1 атм (температура плюс 121 °C) в течение 15 минут. Охлаждать до температуры плюс 45 - 50 °C, асептически добавить 6,25 мл 10% стерильного раствора соответствующего углевода. Тщательно перемешивать, разлить по пробиркам с поплавками.