Выявление ботулинических токсинов в реакции нейтрализации

--------------------------------

<29> ГОСТ 10444.7-86; Клинические рекомендации 2025 - 2026 - 2027.

3.35. Выявление ботулинических токсинов проводят в соответствии со схемой, представленной на рисунках 2 - 3, в таблицах 3 - 4 или одновременно с использованием противоботулинических антитоксических сывороток в соответствии с таблицей 5. Исследования проводят с подготовленной пробой (далее - ПП), если в ней ботулинический токсин не обнаружен, то ПП обрабатывают протеолитическим ферментом (далее - ППТ).

Для обнаружения токсина в реакции нейтрализации берут 4 мышей весом 16 - 20 г. В связи с тем, что в исследуемом материале могут находиться два и больше типов ботулинических токсинов, то предварительную реакцию ставят со смесью противоботулинических диагностических сывороток типов A, B, C, E, F.

3.36. Двум мышам вводят исследуемый фильтрат или центрифугат в количестве не менее 0,5 мл внутрибрюшинно или внутривенно в хвостовую вену (внутривенно вводится только центрифугат). Другой паре вводят смесь, состоящую из 0,5 - 0,8 мл (испытуемого материала и 0,2 мл смеси диагностических моновалентных противоботулинических сывороток типов A, B, C, E, F (по 0,04 мл сыворотки каждого типа). С этой целью выпускают сухие типоспецифические диагностические сыворотки, титр которых должен быть в пределах, указанных в таблице 2.

Таблица 2

Титр специфических диагностических сывороток

3.37. Доза сыворотки, которая рекомендуется для реакции нейтрализации, как правило, обеспечивает нейтрализацию гомологического токсина в исследуемой пробе.

3.38. Не используют для целей диагностики лечебные противоботулинические сыворотки.

3.39. Перед введением смесь испытуемого материала и сывороток выдерживают при комнатной температуре в течение 30 минут. Количество исследуемого материала, вводимого животным с сывороткой и без сыворотки, используют одинаковое. Наблюдение за животными ведут в течение 4 дней, однако, если мыши болеют или погибают раньше этого срока, то тут же ставят реакцию нейтрализации с моновалентными сыворотками.

3.40. При наличии ботулинического токсина погибают две мыши, которым вводился не смешанный с сыворотками фильтрат, остальные остаются живы.

3.41. В случае обнаружения в пробе ботулинического токсина ставят развернутую реакцию нейтрализации для определения типа токсина с типоспецифическими диагностическими сыворотками. В 6 пробирок разливают по 0,8 мл исследуемого фильтрата, затем в каждую пробирку добавляют по 0,2 мл сыворотки: в первую пробирку сыворотку типа A, во вторую - типа B, в третью - типа C, в четвертую - типа E, в пятую - типа F и в шестую добавляют 0,2 мл физиологического раствора. Смесь после 30 минут выдерживания при комнатной температуре вводят внутривенно или внутрибрюшинно по 0,5 мл двум мышам из каждой пробирки (таблица 3).

3.42. Для каждой сыворотки берут отдельный шприц. Учет результатов проводят через 4 - 6 часов, 24 часа и далее на протяжении 4 суток. При наличии ботулинического токсина выживают мыши, получившие смесь токсина и гомологической сыворотки, при гибели всех остальных мышей. Тип сыворотки, нейтрализующей токсин, указывает на типовую принадлежность токсина. Например, если гибнут все мыши, кроме тех, которым введено содержимое пробирки N 1, то в исследуемом материале будет установлен токсин типа A.

Таблица 3

Рекомендуемый протокол постановки развернутой

реакции нейтрализации

3.43. Особое внимание обращают на постановку реакции нейтрализации с сывороткой больного, так как обычно ее бывает не большой объем. Тщательно отделяют сыворотку от сгустка крови (сгусток крови засевают на питательные среды, так как при ботулизме можно обнаружить в крови возбудителя ботулизма) и с сывороткой ставят реакцию нейтрализации. В этом случае ставят развернутую реакцию нейтрализации с моновалентными ботулиническими сыворотками типов A, B, C, E и F. Для этого в пять пробирок (типа "Эппендорф") поровну разливают всю сыворотку больного, а затем в первую пробирку добавляют диагностическую сыворотку типа A, во вторую - типа B, в третью - типа E и т.д. Все содержимое каждой пробирки вводят поровну двум мышам. Например, если в каждую пробирку налили по 0,8 мл сыворотки больного, а затем по 0,2 мл диагностической сыворотки, всего в пробирке будет 1,0 мл смеси. Эту смесь вводят внутрибрюшинно мышам по 0,5 мл. При получении недостаточного количества сыворотки крови, составляют пропорцию соотношения сыворотки крови больного к моновалентной ботулинической сыворотки 4:1 и используют минимальное количество реакционной смеси для введения лабораторным животным не менее 0,2 мл (оптимально 0,5 мл). Животные, которым исследуемый материал вводили в смеси с гомологичной сывороткой, остаются живыми, остальные погибают с клиническими признаками ботулизма.

3.44. При получении положительной реакции нейтрализации с диагностическими ботулиническими сыворотками делают заключение о наличии в исследуемом материале ботулинического токсина и указывают его тип.

3.45. Установлено, что противоботулиническая сыворотка типа E в известной мере нейтрализует и ботулинический токсин типа F. При получении положительной реакции с противоботулинической сывороткой типа E дополнительно проводят дифференциальную диагностику для более точного определения типа токсина (тип E или тип F). Для этого ставят реакцию нейтрализации на мышах параллельно с двумя противоботулиническими диагностическими сыворотками типа E и типа F. Для этого в три пробирки вносят по 2,4 мл испытуемого экстракта, а затем в первую пробирку добавляют 0,6 мл диагностической сыворотки типа E, во вторую - 0,6 мл типа, в третью, контрольную - 0,6 мл физиологического раствора. Если мыши погибают в контроле и с сывороткой типа E, то в экстракте имеется токсин типа F, если же погибают наряду с контролем и мыши, которым введена смесь с сывороткой типа F, а выживают только мыши с сывороткой E, то в экстракте токсин типа E.

3.46. Для выявления ботулинических токсинов по таблице 4 используют ПП. В две пробирки пипетирующим устройством переносят по 2 - 3 мл, а в третью - 2,7 мл ПП. В последнюю пробирку стерильной пипеткой добавляют 0,3 мл раствора трипсина или панкреатина. В смеси ПП с ферментом с помощью раствора гидроокиси натрия или раствора соляной кислоты устанавливают pH (6,0 +/- 1). Затем пробирку со смесью термостатируют при температуре плюс (36 +/- 1) °C в течение 1 часа, но не дольше, периодически перемешивают содержимое. Культуральную жидкость, полученную из посевов продуктов в питательную среду, содержащую трипсин или панкреатин, протеолитическим ферментом не обрабатывают. Вторую пробирку с ПП кипятят на водяной бане в течение 10 минут и охлаждают до комнатной температуры. Первую пробирку с ПП оставляют без обработки. ППТ не хранят.

Рисунок 2. Биопроба на мышах с материалом, подозрительным

на наличие ботулинического токсина

Рисунок 3. Схема постановки реакции нейтрализации

с ботулиническими токсинами

Таблица 4

Постановка исследований по обнаружению ботулинического

токсина и определению титра токсина в ПП

Таблица 5

Постановка исследований по обнаружению и типированию

ботулинических токсинов

3.47. Непосредственно после окончания обработки ППТ ставят биологическую пробу на белых мышах. По 0,5 - 1,0 мл подготовленной соответствующим образом пробы вводят в зависимости от условий опыта внутрибрюшинно (сыворотку внутривенно) не менее чем двум белым мышам, в соответствии с приложением 1 к настоящим МУ. Животных осматривают через 1, 2, 4, 12 часов и далее не менее двух раз в день в течение 72 часов. Ботулинические токсины обычно не вызывают молниеносной гибели животных; клинические симптомы ботулинической интоксикации животных токсином типа E, как правило, появляются через 2 - 4 часа, токсином других типов - через 10 - 12 часов после инъекции. Высокие концентрации токсина могут вызвать гибель мышей в течение 1 - 2 часа, редко в течение 2 - 3 минут без проявления характерной клиники ботулизма. В этом случае ставят повторно биологическую пробу с исходной жидкостью, разведенной в 10 - 100 раз. При разведении проб посторонняя микрофлора теряет способность вызывать гибель мышей, а ботулинические токсины, обладая обычно большей биологической активностью, будут вызывать гибель мышей даже при разведении фильтратов. Мыши болеют и погибают не раньше, чем через 2 часа после инъекции токсина, чаще всего в течение 4 - 6 часов. Клинические симптомы болезни и гибели мышей при ботулинической интоксикации характерны: шерсть взъерошивается, дыхание затруднено, мышцы брюшной стенки ослаблены и западают, давая симптом "осиная талия"; появляются судороги, паралич задних конечностей; гибель при явлениях полного паралича из-за остановки дыхания.

3.48. При наличии в ПП ботулинического токсина болеют и погибают с клиническими симптомами ботулинической интоксикации те животные, которым введена необработанная протеолитическим ферментом проба, и, если фермент не инактивировал ботулинический токсин, то болеют и погибают животные, которым введена проба, обработанная протеолитическим ферментом. При наличии в ПП ботулинических протоксинов болеют и погибают с клиническими симптомами ботулинической интоксикации в первую очередь те животные, которым введена обработанная ферментом проба; мыши, которым введена не обработанная ферментом проба, могут переболеть, но не погибают или погибают позже. Мыши, которым введена термически обработанная проба, остаются на всем протяжении опыта здоровыми. Если болеют или погибают мыши, получившие термически обработанную и непрокипяченную пробу, то ПП разводят буферным желатино-фосфатным раствором в соотношении 1:1 и 1:9 и повторяют исследования по вышеописанному методу с тем, чтобы избежать гибели животных от термически обработанной пробы или подтвердить, что клинические признаки гибели животных по всем вариантам опыта не соответствуют признакам ботулинической интоксикации.

3.49. При наличии в ПП ботулинических токсинов все последующие исследования проводят с необработанной пробой; ботулинических протоксинов - с ППТ.