Метод ИФА для выявления ботулотоксинов

--------------------------------

<37> Клинические рекомендации 2025 - 2026 - 2027.

3.80. Наиболее распространенным иммунологическим тестом для выявления ботулотоксинов является ИФА. Материалом для исследования при постановке ИФА могут быть сыворотка, плазма, гомогенат из органов, клеточные лизаты, различные пищевые продукты, объекты окружающей среды. Из образцов готовят аликвоты, которые хранят при температуре минус 20 °C в течение не более 3 месяцев или при температуре минус 80 °C в течение не более 6 месяцев. В случае использования образцов в течение 24 часов, допускается их хранение при температуре плюс (4 +/- 1) °C. Образцы, в которых предполагается наличие токсина, добавляют к токсинспецифическим поликлональным или моноклональным антителам. Комплексы токсин-антитело выявляют, используя второе токсинспецифическое антитело, связанное с ферментом (фосфатазой или пероксидазой), генерирующим световой сигнал посредством ферментативного расщепления хромогенного субстрата. С развитием методов усиления сигнала ИФА этот метод по чувствительности сравним с биопробой. Существует вариант метода ИФА для обнаружения нейротоксинов C. botulinum типов A, B, E и F. В анализе используют поликлональные антитела, специфичные к указанным типам токсинов, в качестве вторичных антител применяют дигоксигенин. Этот метод детектирования требует добавления хромогенного субстрата и антител против дигоксигенина, конъюгированного с пероксидазой хрена. Чувствительность этого теста для токсина A, обнаруженного в различных образцах пищевых продуктов, составила ~60 пг/мл. Недавно разработан метод ИФА для одновременного обнаружения нейротоксинов серотипов A, B, C, D, E и F с чувствительностью ~0,2 пг/мл.

3.81. Постановку и учет результатов ИФА осуществляют согласно инструкции производителя по применению диагностической иммуноферментной тест-системы для определения ботулинических токсинов. Алгоритм проведения исследований приведен в п.п. 3.82 - 3.93.

3.82. Перед использованием набора доводят температуру всех реагентов до комнатной, сразу после использования охлаждают все реагенты до температуры плюс (4 +/- 1) °C. В процессе выполнения анализа не допускают высыхания лунок планшета. Воспроизводимость результатов ИФА существенно зависит от тщательности отмывки планшета в процессе анализа. На всех стадиях инкубации избегают воздействия прямого солнечного света. При инкубации прикрывают планшет крышкой.

3.83. Приготовление моющего буфера. Для приготовления моющего буфера смешивают 1 часть концентрированного моющего буфера и 99 частей дистиллированной воды (например, 10 мл концентрата и 990 мл деионизированной или дистиллированной воды). Если во флаконе с концентрированным буфером образовались кристаллы, предварительно их растворяют, нагревая флакон в водяной бане при температуре плюс (37 +/- 1) °C. Хранят готовый моющий буфер при температуре плюс (4 +/- 1) °C не более двух недель. Температуру моющего буфера перед его использованием доводят до комнатной.