Таблица 1

3.9. Для выявления ДНК генно-инженерно-модифицированных микроорганизмов в пробах с различными уровнями содержания микробной ДНК и ДНК пищевого субстрата используют два вида тест-систем:

- комплект N 1А для выделения ДНК из ферментных препаратов, стартерных и заквасочных культур, БАД;

- комплект N 1Б для выделения ДНК из пищевых продуктов.

3.10. Выделение ДНК из бактериальных культур с помощью комплекта N 1А включает лизис бактериальных клеток с последующим осаждением ДНК на двуокиси кремния. Выделение ДНК из образцов пищевых продуктов с помощью комплекта N 1Б включает предварительную обработку пробы гомогенизированных образцов протеиназой К, лизис, дополнительную обработку депротеинизирующим раствором и осаждение ДНК на двуокиси кремния.

3.11. Для выявления ГММ и МГМА в пищевых продуктах используют следующие материалы, оборудование, реактивы:

1) программируемый термостат (ДНК-амплификатор) типа "Терцик МС2" или иные типы амплификаторов, зарегистрированные в Российской Федерации в установленном порядке;

2) термостат, поддерживающий температуру +45 °C, для пробирок объемом 1,5 мл;

3) центрифуга со скоростью вращения ротора до 12 000 об./мин. для пробирок вместимостью 1,5 и 0,5 мл типа "эппендорф";

4) встряхиватель вибрационный типа "вортекс" со скоростью вращения до 3 000 об./мин.;

5) прибор для горизонтального электрофореза;

6) источник постоянного тока;

7) водяная баня с подогревом до +95 °C или СВЧ-печь;

8) ультрафиолетовый трансиллюминатор;

9) очки/маска защитные;

10) холодильник бытовой электрический;

11) морозильная камера, обеспечивающая температуру (-20) °C или ниже;

12) гомогенизатор типа "SilentCrusher" или других моделей;

13) ступка фарфоровая с пестиком;

14) пинцет медицинский;

15) ножницы медицинские;

16) скальпель медицинский;

17) весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности;

18) дистиллятор;

19) анализатор потенциометрический;

20) облучатель бактерицидный настенный;

21) дозаторы с переменным объемом дозирования: 0,2 - 2,0 мм3 с шагом 0,01 мм3, 0,5 - 10,0 мм3 с шагом 0,01 мм3, 2 - 20 мм3 с шагом 0,01 мм3, 20 - 200 мм3 с шагом 0,1 мм3, 100 - 1000 мм3 с шагом 1 мм3, 2 - 10 см3 с шагом 0,1 см3;

22) пробирки типа "эппендорф" вместимостью 1,5 мл;

23) пробирки типа "эппендорф" для ПЦР вместимостью 0,5 мл;

24) наконечники полимерные объемом 1 - 200 мкл;

25) наконечники полимерные объемом 200 - 1000 мкл;

26) перчатки резиновые;

27) колбы плоскодонные конические разной вместимости;

28) цилиндры стеклянные мерные лабораторные вместимостью 25, 100, 1000 см3;

29) воронки стеклянные;

30) штативы для пробирок объемом 1,5 и 0,5 мл;

31) комплект N 1А для выделения ДНК из ферментных препаратов, стартерных и заквасочных культур, БАД к пище;

32) комплект N 1Б для выделения ДНК из пищевых продуктов;

33) комплект N 2 "Набор реагентов для выявления селективных маркеров генетически модифицированных микроорганизмов";

34) комплект N 3 "Набор реагентов для выявления селективных маркеров генетически модифицированных микроорганизмов";

35) реактивы:

- тритон X-100,

- гуанидина гидрохлорид,

- ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота),

- додецилсульфат натрия,

- суспензия двуокиси кремния,

- фенол водонасыщенный,

- хлороформ водонасыщенный,

- спирт этиловый ректификованный,

- ацетат аммония,

- протеиназа К,

- магния хлорид,

- калия хлорид,

- водный раствор дезоксинуклетидтрифосфатов (0,1 М),

- креозоловый красный,

- термостабильная ДНК-полимераза,

- масло вазелиновое,

- трис-ацетат,

- ледяная уксусная кислота,

- агароза для электрофореза,

- бромистый этидий,

- вода деионизированная.

3.12. Допускаются к использованию тест-системы, комплекты (наборы) реагентов и материалы аналогичного назначения других типов, разрешенные к применению в установленном порядке и с характеристиками, обеспечивающими проведение исследований в соответствии с настоящими Методическими указаниями.

3.13. Отобранные согласно установленному порядку и нормам отбора проб (в соответствии с официально утвержденными нормативными и техническими документами) образцы подготавливают к процедуре выделения ДНК ГММ и МГМА двумя способами, в зависимости от их принадлежности к группам пищевой продукции:

- из образцов проб ферментных препаратов, заквасочных и стартерных культур, БАД готовят растворы 30%-й концентрации в стерильной деионизированной воде. Для этого вносят 300 мг (мкл) порошка или суспензии исходного образца в 700 мкл стерильной деионизированной воды и перемешивают на вихревом смесителе в течение 3 - 5 с. При необходимости образец предварительно измельчают до гомогенного состояния в ступке или с помощью гомогенизатора;

- из образцов других пищевых продуктов готовят растворы 50%-й концентрации, для чего к 500 мг (мкл) пробы добавляют 500 мкл стерильной деионизированной воды и перемешивают на вихревом смесителе в течение 3 - 5 с. Твердый образец предварительно измельчают до гомогенного состояния в ступке или с помощью гомогенизатора.

Подготовленные образцы используют для анализа в тот же день. Допускается хранение образцов при температуре минус 20 °C не более 2-х недель.

3.14. Выделение ДНК ГММ и МГМА из образцов исследуемой пищевой продукции проводят с использованием комплектов (наборов) реагентов для выявления селективных маркеров генно-инженерно-модифицированных микроорганизмов. Допускается применение фенол-хлороформного или другого адекватного метода экстракции ДНК.

3.15. Выделение ДНК из заквасочных и стартерных культур, БАД к пище, ферментных препаратов проводят с использованием комплекта N 1А "Набор реагентов для выявления селективных маркеров генетически модифицированных микроорганизмов".

Комплект N 1А для выделения ДНК включает:

- лизирующий раствор, содержащий гуанидинтиоцианат (раствор 1) - 1 фл. (30 мл);

- раствор для отмывки, содержащий гуанидинтиоцианат (раствор 2) - 1 фл. (15 мл);

- раствор для отмывки (раствор 3) - 2 фл. (по 70 мл);

- суспензия двуокиси кремния - 1 пробирки (0,5 мл).

3.15. Выделение ДНК комплектом N 1А включает следующие этапы:

- исследуемый материал в объеме 700 мкл центрифугируют в течение 10 минут при комнатной температуре (+18 - 25 °C) при 12000 об./мин.;

- удаляют 600 мкл надосадочной жидкости; оставшийся материал (100 - 110 мкл) тщательно перемешивают в пробирке на вортексе и добавляют к суспензии 300 мкл раствора 1 и 5 мкл суспензии двуокиси кремния;

- пробы инкубируют в течение 15 минут при комнатной температуре, периодически перемешивая на вортексе;

- пробы центрифугируют в течение 30 сек., при комнатной температуре при 12000 об./мин., супернатант удаляют;

- к осадку добавляют 150 мкл раствора 2, встряхивают его на вортексе и центрифугируют в течение 30 сек. при комнатной температуре при 12000 об./мин., супернатант удаляют;

- к осадку добавляют 700 мкл раствора 3, встряхивают его на вортексе и центрифугируют в течение 30 сек. при комнатной температуре при 12000 об./мин., супернатант удаляют; проводят повторную процедуру отмывки;

- дополнительным центрифугированием с последующим удалением супернатанта убирают остатки раствора 3, пробы подсушивают в течение 5 мин. при температуре +45 °C, оставляя пробирки открытыми;

- добавляют в каждую пробирку 50 мкл деионизированной воды, перемешивают на вортексе и инкубируют в течение 5 мин. при температуре +45 °C;

- пробы центрифугируют при комнатной температуре в течение 30 сек. при 12000 об./мин., водную фазу отбирают в другую пробирку и используют в качестве исследуемого образца ДНК для постановки реакции амплификации либо хранят при температуре -20 °C не более двух недель.

3.16. Выделение ДНК ГММ и МГМА из пищевых продуктов проводят с использованием комплекта N 1Б "Набор реагентов для выявления селективных маркеров генетически модифицированных микроорганизмов". При повышенном содержании жиров проводится дополнительная экстракция суспензией неполярных растворителей с водой для перевода содержащейся в пищевом продукте ДНК в водную фазу, в которой и производится дальнейшая очистка.

Комплект N 1Б для выделения ДНК из пищевых продуктов включает:

- раствор 1 (лизирующий буфер, pH 8,0) - 1 фл. (15 мл);

- раствор 2 (смесь фенола с хлороформом, 1:1) - 1 фл. (20 мл);

- раствор 3 (хлороформ) - 1 фл. (20 мл);

- раствор 4 (ацетат аммония 5 М) - 1 фл. (5,0 мл);

- раствор 5 (спирт этиловый 96%) - 4 фл. (по 20 мл);

- раствор 6 (спирт этиловый 75%) - 1 фл. (12 мл);

- раствор 7 (ТЕ-буфер, pH 8,0) - 1 фл. (6,0 мл);

- протеиназу К - 1 пробирки (3,0 мг).

3.17. Выделение ДНК комплектом N 1Б включает следующие этапы:

- раствор 1 прогревают при температуре +25 °C до полного растворения осадка, непосредственно перед применением к раствору 1 добавляют протеиназу К до концентрации 200 мкг/мл (0,001 г на 5,0 мл);

- в полипропиленовую пробирку вместимостью 1,5 мл вносят 100 мкл гомогенизированного образца, добавляют 100 мкл раствора 1, перемешивают на вихревом смесителе в течение 3 - 5 сек.;

- пробирки инкубируют при температуре +55 °C в течение 40 мин.;

- добавляют 200 мкл (равный объем) раствора 2, перемешивают на вихревом смесителе в течение 10 сек. и центрифугируют при комнатной температуре (+18 - 25 °C) в течение 5 мин. при 10000 - 12000 об./мин. (10000 - 13000 g);

- отбирают верхнюю (водную) фазу и вносят ее в полипропиленовую пробирку вместимостью 1,5 мл, в эту пробирку добавляют 200 мкл (равный объем) раствора 3;

- перемешивают на вихревом смесителе в течение 3 - 5 сек. и центрифугируют при комнатной температуре 2 мин. при 10000 - 12000 об./мин. (10000 - 13000 g).

Отбирают водную фазу (200 мкл) и вносят ее в полипропиленовую пробирку вместимостью 1,5 мл, в эту пробирку добавляют 40 мкл раствора 4 и 720 мкл (3 объема) раствора; перемешивают на вихревом смесителе в течение 3 - 5 сек.;

- инкубируют при комнатной температуре в течение 40 мин.;

- центрифугируют при комнатной температуре (+18 - +25 °C) в течение 15 мин. при 12000 об./мин. (13000 g); супернатант удаляют;

- в пробирку вносят 100 мкл раствора 6;

- центрифугируют в течение 1 мин. при комнатной температуре при 12000 об./мин. (13000 g); супернатант удаляют; осадок сушат на воздухе в течение 10 мин.;

- растворяют осадок в 50 мкл раствора 7; полученные образцы ДНК используют для дальнейшего анализа.

3.18. Проведение ПЦР осуществляют с использованием комплекта N 2 реагентов для амплификации ДНК "Набор реагентов для выявления селективных маркеров генетически модифицированных микроорганизмов".

Комплект N 2 реагентов для амплификации ДНК включает:

- ПЦР-смесь 1 (реакционный буфер, смесь олигонуклеотидных праймеров и дезоксинуклеозидтрифосфатов) - 8 пробирок по 1300 мкл;

- ПЦР-смесь 2 (термостабильная ДНК-полимераза) - 4 пробирки (200 мкл);

- масло минеральное - 8 пробирок по 1300 мкл;

- положительные контрольные образцы ДНК (плазмидная ДНК с клонированным специфическим фрагментом соответствующих маркерных генов) - 4 пробирки по 30 мкл;

- отрицательные контрольные образцы (плазмидная ДНК pET-9) - 4 пробирки по 30 мкл.

3.19. Проведение ПЦР с использованием комплекта N 2 включает следующие этапы:

- перед началом работы вынимают из морозильной камеры комплект реагентов для амплификации (кроме ПЦР-смеси 2), размораживают содержимое пробирок при комнатной температуре, тщательно перемешивают на вихревом смесителе в течение 10 сек. и помещают все пробирки в холодильник;

- амплификационные пробирки вместимостью 0,2 (или 0,5) мл маркируют в соответствии с маркировкой анализируемых образцов, пробирки для положительного контрольного образца ДНК маркируют как ПК, для отрицательного контрольного образца - ОК;

- рабочий раствор для проведения реакции амплификации готовят в количестве, достаточном для анализа всех проб (при анализе N образцов рабочий раствор готовится в количестве, необходимом для анализа N+1 образцов); для этого в пробирку вместимостью 1,5 мл вносят из расчета на одну пробу по 25 мкл ПЦР-смеси 1 и по 2,0 мкл ПЦР-смеси 2; тщательно перемешивают;

- в каждую пробирку с анализируемыми образцами и в пробирки ПК и ОК вносят по 27 мкл рабочего раствора;

- в каждую пробирку добавляют по 1 капле (или 20 мкл) минерального масла;

- в каждую пробирку с анализируемыми образцами вносят под масло по 3,0 мкл исследуемой ДНК (используют наконечники с аэрозольным барьером) и закрывают их.

В пробирку, маркированную ОК, внести под масло 3,0 мкл отрицательного контрольного образца и закрыть ее:

- в пробирку, маркированную ПК, вносят под масло 3,0 мкл положительного контрольного образца ДНК и закрывают ее;

- содержимое пробирок осторожно перемешивают пипетированием и центрифугируют при комнатной температуре в течение 5 сек. при 10000 об./мин. (11000 g);

- все пробирки устанавливают в блок амплификатора и проводят амплификацию с учетом объема реакционной смеси, равного 30 мкл; программа амплификации представлена в таблице 2:

3.20. Результаты ПЦР регистрируют методом электрофореза в 1,2% агарозном геле, приготовленном на 1-кратном трис-ацетатном (ТАЕ) буфере с использованием комплекта N 3 "Набор реагентов для выявления селективных маркеров генетически модифицированных микроорганизмов".

3.21. Детекция результатов ПЦР методом электрофореза включает следующие этапы:

- приготовление ТАЕ буфера: 20 мл 50-кратного концентрированного ТАЕ буфера вносят в мерную колбу вместимостью 1000 мл, доводят до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают;

- приготовление 1,2% агарозного геля: 0,6 г агарозы растворяют в 50 мл 1 x ТАЕ буфера нагреванием в кипящей водяной бане до полного и равномерного растворения, полученный раствор охлаждают до температуры +60 °C, добавляют 6 мкл 1% раствора бромистого этидия и перемешивают (примечание: бромистый этидий является сильным мутагеном, поэтому все манипуляции с ним и с агарозным гелем выполняют в перчатках);

- проведение электрофореза: полученный раствор агарозы заливают в кювету для геля согласно инструкции к прибору для горизонтального электрофореза;

- для создания стартовых лунок в кювету помещают гребенку с зубцами, полимеризация агарозы происходит при температуре ниже +42 °C в течение 10 - 20 мин.;

- после застывания агарозы осторожно вынимают гребенку и переносят гель в камеру для проведения электрофореза, в камеру заливают 1 x ТАЕ буфер так, чтобы толщина слоя жидкости над гелем составляла приблизительно 5 мм;

- вносят в лунки агарозного геля по 12,5 мкл амплифицированных образцов, подключают к камере источник постоянного тока и проводят электрофорез при напряжении 120 В в течение примерно 20 мин., помещая стартовые лунки ближе к катоду;

- вынимают гель из камеры, переносят его на стекло трансиллюминатора, включают трансиллюминатор и просматривают гель с последующей видео- или фотодетекцией результатов. Фотоотпечатки или оттиски, выполненные на лазерном принтере с разрешением не менее 600 точек на дюйм, прикладывают к протоколу проведения испытаний.

3.21. Интерпретацию результатов ПЦР проводят следующим образом:

- в положительном контрольном образце ДНК должна выявляться полоса красно-оранжевого цвета, соответствующая по размеру специфическим фрагментам селективных маркеров ГММ;

- в отрицательном контрольном образце полоса красно-оранжевого цвета должна отсутствовать;

- наличие в анализируемом материале полосы красно-оранжевого цвета, располагающейся строго на уровне полосы положительного контрольного образца ДНК, свидетельствует о наличии в исследуемом образце соответствующего селективного маркерного гена ГММ. При отсутствии такой полосы результат считают отрицательным;

- наличие полосы красно-оранжевого цвета в отрицательном контрольном образце, располагающейся на уровне полосы положительного контрольного образца ДНК, считают результатом контаминации.