III. Молекулярно-генетический анализ пищевой продукции, полученной с использованием генно-инженерно-модифицированных микроорганизмов и микроорганизмов, имеющих генно-инженерно-модифицированные аналоги, методом ПЦР с детекцией результатов методом электрофореза

3.1. Необходимость проведения лабораторных исследований для конкретных видов пищевой продукции, полученной с использованием ГММ и МГМА, определяется экспертом с учетом анализа представленной заявителем документации, перечня микроорганизмов, используемых в пищевой промышленности и имеющих генно-инженерно-модифицированные аналоги. Экспертные исследования включают подтверждение данных, предоставленных заявителем, а при необходимости - проверку на наличие возможных недекларированных генетических модификаций.

3.2. Для обнаружения ГММ проводят исследования на наличие трансгенов (чужеродных генов), регуляторных или маркерных векторных последовательностей. Наличие таких последовательностей свидетельствует о произведенных генетических модификациях. Обнаружение последовательностей таких генов производят с помощью специфичного и высокочувствительного метода полимеразной цепной реакции (ПЦР).

3.3. Рекомендуемые стратегии международных организаций (ФАО/ВОЗ) для выявления генетических модификаций предусматривают определение наиболее часто употребляемых последовательностей векторов - плазмид, с помощью которых генетическая информация вводится в клетку. В качестве маркеров используют гены, по которым проводят селекцию модифицированных клеток (гены антибиотикорезистентности, бактериоцинов), последовательности регуляторных векторных генов (полилинкеры, промоторы или терминаторы), а также последовательности мигрирующих элементов. Обнаружение таких последовательностей свидетельствует о возможных недокументированных генетических модификациях и требует проведения дополнительных исследований штаммов и/или продуктов.

3.4. Проведение дополнительных исследований осуществляют с использованием методов гибридизационного и рестрикционного анализа, секвенирования, анализа функционирования целевой вставки (изучение РНК и белка, продуцируемых чужеродной ДНК) в соответствии с официально утвержденными методами анализа.

3.5. Для качественного определения ДНК генно-инженерно-модифицированных микроорганизмов в пищевых продуктах и биологически активных добавках к пище (БАД) методом ПЦР используют тест-системы, включающие многокомпонентные наборы реагентов и праймеров (искусственно синтезированных олигонуклеотидов, комплементарных соответствующим участкам ДНК-мишени), предназначенные для выявления селективных маркерных генов, наиболее часто употребляемых при конструировании ГММ. Обнаружение маркерных генов у штаммов микроорганизмов, используемых при производстве пищевых продуктов, свидетельствует о произведенных генетических модификациях.

В тест-системы входят праймеры, фланкирующие следующие последовательности:

1) гена ermC, кодирующего устойчивость к эритромицину, плазмиды pE194 Staphylococcus aureus (размер фрагмента 349 п.н.);

2) гена tetO, кодирующего устойчивость к тетрациклину хромосомы Streptococcus pneumoniae (размер фрагмента 242 п.н.);

3) гена amp, кодирующего устойчивость к ампициллину, плазмиды pBR322 Esherichia coli (размер фрагмента 321 п.н.);

4) гена lacZ, кодирующего фермент бета-галактозидазу, хромосомы Esherichia coli (размер фрагмента 158 п.н.);

5) гена ori, кодирующего ориджин репликации, плазмиды p15A Esherichia coli (размер фрагмента 382 н.п.);

6) гена hph, кодирующего устойчивость к гигромицину, хромосомы Streptomyces hygroscopicus (размер фрагмента 288 н.п);

7) гена Sh ble, кодирующего устойчивость к блеомицину, хромосомы Streptomyces verticillus (размер фрагмента 301 н.п.).

3.6. Выбранный в соответствии с правилами молекулярного дизайна и международных баз данных (с применением программ "Oligo 4.0", "Blast" и их аналогов) набор праймеров обеспечивает проведение многофакторного анализа выбранных последовательностей.

3.7. Для каждой конкретной пары праймеров ПЦР проводят с использованием оптимального соотношения компонентов реакционной смеси, структуры программы амплификации (временных и температурных характеристик каждого этапа амплификации) и адекватного метода детекции результатов, для исключения перекрестных реакций с неспецифическими ДНК и обеспечения необходимого уровня чувствительности и специфичности реакции.