IV. Молекулярно-генетический анализ пищевой продукции, полученной с использованием генно-инженерно-модифицированных микроорганизмов и микроорганизмов, имеющих генно-инженерно-модифицированные аналоги, методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени

4.1. Для выявления ГММ и МГМА в пищевых продуктах методом ПЦР в реальном времени используют следующие материалы, оборудование, реактивы:

1) амплификатор с оптической приставкой типа Rotor Gene - 3000, ABI Prism 7000, iCycler IQ или отечественные аналоги;

2) компьютер, совместимый с программным обеспечением амплификаторов с оптической приставкой;

3) оптические 96-луночные планшеты типа MicroAmp;

4) оптические крышки типа MicroAmp;

5) оптически прозрачные адгезивные пленки;

6) термостат, поддерживающий температуру +45 °C, для пробирок объемом 1,5 мл;

7) центрифуга со скоростью вращения ротора до 12000 об./мин. для пробирок вместимостью 1,5 и 0,5 мл типа "эппендорф";

8) встряхиватель вибрационный типа "вортекс" со скоростью вращения до 3000 об./мин.;

9) очки/маска защитные;

10) холодильник бытовой электрический;

11) морозильная камера, обеспечивающая температуру (-20) °C или ниже;

12) гомогенизатор типа "SilentCrusher" или других моделей;

13) ступка фарфоровая с пестиком;

14) пинцет медицинский;

15) ножницы медицинские;

16) скальпель медицинский;

17) весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности;

18) дистиллятор;

19) анализатор потенциометрический;

20) облучатель бактерицидный настенный;

21) дозаторы с переменным объемом дозирования:

0,2 - 2,0 мм3 с шагом 0,01 мм3, 0,5 - 10,0 мм3 с шагом 0,01 мм3, 2 - 20 мм3 с шагом 0,01 мм3, 20 - 200 мм3 с шагом 0,1 мм3, 100 - 1000 мм3 с шагом 1 мм3, 2 - 10 см3 с шагом 0,1 см3;

22) пробирки типа "эппендорф" вместимостью 1,5 мл;

23) пробирки типа "эппендорф" для ПЦР вместимостью 0,5 мл;

24) наконечники полимерные объемом 1 - 200 мкл;

25) наконечники полимерные объемом 200 - 1000 мкл;

26) перчатки резиновые;

27) колбы плоскодонные конические разной вместимости;

28) цилиндры стеклянные мерные лабораторные вместимостью 25, 100, 1000 см3;

29) воронки стеклянные;

30) штативы для пробирок объемом 1,5 и 0,5 мл;

31) комплект N 2 (модифицированный) реагентов для амплификации ДНК "Набор для выделения ДНК из ферментных препаратов, стартерных и заквасочных культур, БАД к пище";

32) реактивы:

- тритон Х-100,

- гуанидина гидрохлорид,

- ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота),

- додецилсульфат натрия,

- суспензия двуокиси кремния,

- фенол водонасыщенный,

- хлороформ водонасыщенный,

- спирт этиловый ректификованный,

- ацетат аммония,

- протеиназа K,

- магния хлорид,

- калия хлорид,

- водный раствор дезоксинуклетидтрифосфатов (0,1 М),

- креозоловый красный,

- термостабильная ДНК-полимераза,

- масло вазелиновое,

- трис-ацетат,

- ледяная уксусная кислота,

- агароза для электрофореза,

- бромистый этидий,

- вода деионизированная.

4.2. Допускаются к использованию оборудование, инструменты и материалы аналогичного назначения других типов, разрешенные к применению в установленном порядке и с характеристиками, обеспечивающими проведение исследований в соответствии с данным документом.

4.3. Выделение ДНК ГММ и МГМА из заквасочных и стартерных культур, БАД, ферментных препаратов и пищевых продуктов осуществляют в соответствии с п. п. 3.13 - 3.17 настоящих Методических указаний.

4.4. ПЦР в реальном времени осуществляют с использованием модифицированного комплекта N 2 реагентов для амплификации ДНК "Набор реагентов для выявления селективных маркеров генетически модифицированных микроорганизмов". Модификация предусматривает использование в реакционной смеси не только праймеров, но и флуоресцентно-меченых зондов, а также использование контрольной ДНК ГММ с известной концентрацией в нескольких десятикратных разведениях.

4.5. Флуоресцентно-меченые зонды представляют собой олигонуклеотиды, комплементарные амплифицируемой последовательности-мишени, содержащие на 5'-конце флуорофор - донорфлуоресцентного излучения, а на 3'-конце - его акцептор (гаситель).

Нарастание флуоресцентного свечения наблюдают после физического разобщения флуорофора и гасителя; разобщение флуорофора и гасителя происходит при гибридизации с амплифицируемым фрагментом ДНК за счет 5'-экзонуклеазной активности Taq-полимеразы, разрушающей зонд после его гибридизации с амплифицируемой последовательностью. Рост регистрируемого флуоресцентного свечения происходит пропорционально нарастанию числа ампликонов. Это позволяет регистрировать накопление продуктов амплификации в реальном времени, а сравнение кинетики флуоресценции ДНК-стандартов и исследуемого образца - определять относительную концентрацию ДНК в образце.

4.6. Зонды синтезируют на автоматическом олигонуклеотидном синтезаторе типа ASM102U фосфитамидным методом в режиме DMT-on, используя фосфорамидиты и полимерный носитель типа Glen Reseach. Для введения на 3'-конец зонда метки диметиламинофенилазобензойной кислоты (DABCYL) в качестве гасителя флуоресценции используют фазу 3'-Dabcyl CPG (типа Glen Reseach) в стандартном режиме синтеза. Введение на 5'-конец зонда флуорофора - донора флуоресценции - осуществляют автоматическим синтезом, при использовании 6-карбоксифлуоресцеин-амидита (FAM-фосфорамидит). Первичную очистку зондов осуществляют на колонках типа Poly-Pac, с последующей дополнительной очисткой в полиакриламидном геле.

4.7. Для ПЦР в реальном времени используют ферменты Taq-полимеразу Termo-Star, или Taq-полимеразу HotRescue, инактивированные антителами, или полимеразу AmpliTaq Gold, обладающие выраженной 5'-экзонуклеазной активностью.

4.8. Для проведения ПЦР в реальном времени используют систему, состоящую из термоциклера (амплификатора) и флуоресцентного детектора продуктов ПЦР в реальном времени.

4.9. Концентрацию ДНК ГММ в образце определяют путем сравнения кинетики флуоресценции ДНК-стандартов в диапазоне разведений контрольных препаратов (10-кратных разведений контрольной ДНК известной концентрации) и исследуемого образца.

4.10. Амплификацию проводят по двухступенчатой программе, объединяющей стадии отжига и элонгации в один этап; конечная концентрация зондов в реакционной смеси - до 200 нМ.

Реакцию проводят в реакционной смеси объемом 50 мкл, включающей в себя: десятикратный реакционный буфер, адаптированный к используемому типу полимеразы; 250 мкМ каждого из 4 дезоксирибонуклеотидтрифосфатов; 300 нМ каждого из праймеров; 200 нМ флуоресцентно-меченого зонда; 5 ед. Taq-полимеразы.

Амплификацию проводят по программе:

1) 1 цикл - 10 мин. -95 °C;

2) 50 циклов: 20 с - 95 °C, 1 мин. - 65 °C.

4.11. Для постановки ПЦР в реальном времени в используемом приборе для амплификации создают специальный протокол в соответствии с инструкциями по пользованию; после завершения создания протокола проверяют наличие в списке режима компенсации базовой линии ПЦР и отмечают используемые флуоресцентные красители. Контрольную ДНК используют в известных разведениях определенной концентрации (стандартах); количество повторов стандартов определяют в соответствии с руководством по эксплуатации прибора.

4.12. Детекцию результатов ПЦР в реальном времени производят автоматически в рамках созданного протокола в графическом и цифровом виде. Автоматический анализ данных происходит следующим образом: последние 95% данных, собранных на каждом шаге, фильтруются средневзвешенным методом. Для экспериментов по амплификации выбирают циклы базовой линии для каждой кривой (образцы) индивидуально с учетом общего оптимального значения порога. По значениям стандартов вычисляют стандартную кривую, на основе которой определяют концентрации ДНК ГММ в исследуемых пробах.