Полногеномное высокопроизводительное секвенирование технологией синтеза (платформа Illumina MiSeq)

--------------------------------

<42> Примечание: для проведения полногеномного высокопроизводительного секвенирования технологией синтеза допускается использовать оборудование с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.102. Приготовление ДНК-библиотек проводят с использованием набора для подготовки библиотек ДНК, включающего этапы: тагментация, амплификация тагментированной ДНК и очистка библиотек.

3.103. Для тагментации концентрацию ДНК нормализуют до 0,2 нг/мкл. К 5 мкл нормализованной ДНК добавляют 10 мкл тагментирующего буфера и 5 мкл амплифицирующей смеси. Пробирки инкубируют при температуре плюс 55 °C 5 минут, охлаждают до температуры плюс 10 °C, добавляют 5 мкл нейтрализующего буфера, центрифугируют (1 минуту при 1700 об/мин) и инкубируют 5 минут при комнатной температуре.

3.104. К тагментированной ДНК добавляют индексы 1 и 2 (в вертикальные ряды - индекс 1, в горизонтальные - индекс 2), затем 15 мкл ПЦР-смеси. После центрифугирования проводят амплификацию в термоциклере: при температуре плюс 72 °C (3 минуты), плюс 95 °C (30 секунд), 12 циклов (плюс 95 °C - 10 секунд, плюс 55 °C - 30 секунд, плюс 72 °C - 30 секунд), финальная элонгация при температуре плюс 72 °C (5 минут).

3.105. Очистку проводят на магнитных частицах: добавляют 30 мкл частиц к образцам, инкубируют, промывают 80% этанолом, высушивают и элюируют ДНК в 52,5 мкл буфера. Концентрацию библиотек измеряют флуориметром.

3.106. Для секвенирования картридж размораживают при комнатной температуре. Библиотеки нормализуют до 4 нмоль/10 мкл, объединяют и денатурируют 0,2 N NaOH.

3.107. Смесь библиотек (5 мкл) обрабатывают 0,2 N NaOH (5 мкл), инкубируют 5 минут, нейтрализуют и разбавляют до 20 пмоль. 600 мкл раствора вносят в картридж.

3.108. Настройка секвенатора включает создание панели образцов, выбор параметров запуска (формат данных, количество циклов) и следование инструкциям на экране.