Полногеномное секвенирование технологией синтеза (платформа Genolab M)

--------------------------------

<43> Примечание: для проведения полногеномного высокопроизводительного секвенирования технологией синтеза допускается использовать оборудование с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.109. Подготовку библиотек проводят с использованием набора для подготовки библиотек ДНК, включая этапы: фрагментация, лигирование адаптеров, очистка, индексная ПЦР.

3.110. Для фрагментации ДНК вносят 10 мкл ДНК с концентрацией 20 нг/мкл в стрипы или пробирки объемом 0,2 мл. Готовят мастер-микс для фрагментации: буфер (3 в 1) - 13,4 мкл, 3-фермент - 1,6 мкл и ДНК-нуклеаза - 1 мкл. Мастер-микс добавляют в образцы ДНК и помещают в амплификатор после выхода прибора в рабочее состояние после первого этапа. Программа для фрагментации: температура плюс +4 °C - , плюс 65 °C - 25 минут, плюс 75 °C - 10 минут и охлаждение образцов - плюс 4 °C.

3.111. Для лигирования адаптеров готовят мастер-микс на необходимое количество реакций: лигазный буфер - 20,5 мкл, адаптеры - 3,5 мкл, лигаза - 1 мкл. Перемешивают, сбрасывают капли с помощью кратковременного центрифугирования. После завершения программы фрагментации вносят по 25 мкл получившегося мастер-микса к образцам. Помещают в амплификатор с установленной программой для лигирования: при температуре плюс 4 °C - , плюс 22 °C - 30 минут, плюс 4 °C - . После установки пробирок в амплификатор пропускают первый шаг.

3.112. После проведения лигирования проводят очистку на магнитных частицах. Для очистки к каждому образцу добавляют 45 мкл магнитных частиц и перемешивают на вортексе до гомогенного состояния. Инкубируют 5 минут при комнатной температуре. Далее помещают образцы на магнитный штатив, инкубируют 3 - 5 минут до прозрачного раствора. После этого удаляют супернатант. Дважды промывают 200 мкл 80% этанолом (свежеприготовленным). Удаляют спирт. Далее высушивают образцы с открытыми крышками при комнатной температуре в течение 10 минут до полного испарения остатков спирта. Добавляют 24 мкл деионизированной, свободной от нуклеаз воды к магнитным частицам. Интенсивно перемешивают пробирки на вортексе, сбрасывают капли с помощью кратковременного центрифугирования. Помещают образцы на магнитный штатив, инкубируют в течение 2 - 3 минут до прозрачного раствора. Переносят 22 мкл элюата в новые пробирки или стрипы, не захватывая магнитные частицы.

3.113. На этапе проведения индексной ПЦР к каждому образцу добавляют по 2 мкл индивидуальных праймерных миксов. Далее готовят мастер-микс на необходимое количество реакций: ПЦР буфер - 25 мкл, ПЦР фермент 1 - 0,5 мкл, ПЦР фермент 2 - 0,75 мкл. Перемешивают мастер-микс, осаждают. Вносят по 26,25 мкл к каждому образцу. Помещают пробирки в амплификатор. Запускают программу для индексной ПЦР: при температуре плюс 95 °C - 2 минуты, плюс 95 °C - 15 секунд, плюс 56 °C - 30 секунд, плюс 72 °C - 17 секунд, плюс 72 °C - 2 минуты, плюс 4 °C - .

3.114. После ПЦР-реакции проводят очистку на магнитных частицах, для этого добавляют 50 мкл магнитных частиц к каждому образцу, перемешивают на вортексе до гомогенного состояния. Инкубируют 5 минут при комнатной температуре. Далее помещают образцы на магнитный штатив, инкубируют 3 - 5 минут до просветления раствора, удаляют супернатант. Дважды промывают 200 мкл 80% этанолом (свежеприготовленным), этанол удаляют. Далее высушивают образцы с открытыми крышками при комнатной температуре в течение 10 минут до полного испарения остатков спирта. Добавляют 22 мкл ТЕ буфера к осадку частиц. Интенсивно перемешивают пробирки на вортексе, сбрасывают капли с помощью кратковременного центрифугирования. Помещают образцы на магнитный штатив, инкубируют в течение 2 - 3 минут до просветления раствора. Переносят 20 мкл элюата в новые пробирки или стрипы, не захватывая магнитные частицы. Концентрацию очищенных библиотек проверяют на флуориметре.

3.115. Получившийся ПЦР-продукт нормализовывают до 4 нмоль в 20 мкл, разбавляя водой лабораторного качества. Нормализованные библиотеки объединяют по 5 мкл каждого образца в пробирке на 1,5 мл - 2 мл. Картридж для секвенирования хранят при температуре минус 15 - 25 °C. Не позднее, чем за 2 часа до запуска, картридж помещают в водяную баню комнатной температуры. Заранее (минимум за 30 мин до запуска) достают загрузочную проточную ячейку, которую хранят при температуре плюс 2 - 8 °C.

3.116. Полученный пул библиотек денатурируют 0,2 N NaOH. В отдельную микроцентрифужную пробирку вносят 800 мкл воды и 200 мкл 1 N NaOH. В результате получают 1 мл 0,2 N NaOH. Раствор перемешивают, перевернув несколько раз. Полученный раствор используют в течение 12 часов. В микроцентрифужной пробирке смешивают 5 мкл 4 нмоль объединенных библиотек и 5 мкл 0,2 н NaOH, полученную смесь перемешивают на вортексе, после чего центрифугируют при 1700 об/мин в течение 1 минуты и инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин. Для остановки реакции денатурации добавляют 5 мкл нейтрализующего реагента. Далее вносят 985 мкл гибридизующего реагента, 20 пмоль смесь библиотек готова. Для получения загрузочной концентрации (2,5 пмоль) в пробирку на 2 мл вносят 187,5 мкл смеси библиотек (концентрация 20 пмоль) и 1312,5 мкл гибридизующего реагента. Полученную пробирку с 2,5 пмоль библиотекой помещают в загрузочный порт для образца в картридже.

3.117. Для подготовки секвенатора к запуску включают прибор и запускают сопряженный с прибором системный блок. Перед тем, как начать процесс секвенирования, осуществляют промывку прибора. Входят в программу, выбирают вкладку "Регулярная промывка". Для промывки используют промывочную ячейку и три промывочные картриджи, которые заполняют растворами: первый - Твин 20 0,05% (в 999,5 мл деионизованной воды растворяют 500 мкл Твин 20); второй - 0,1 N NaOH (в 1 литре деионизованной воды растворяют 4 г гидроксида натрия); третий - деионизованная вода. Суммарное время промывки - 50 минут. На сенсорной панели прибора проверяют показатели температуры охлаждаемого контейнера для реагентов - не более плюс 5 °C. После промывки прибора в программе выбирают вкладку "Секвенирование". Следующим этапом подгружают файл со всей информацией о запуске в формате .csv. Вносят необходимую информацию в следующие ячейки: B2 - название эксперимента, A7 - количество циклов для первой нити ДНК, A8 - количество циклов для второй нити ДНК, B14 - необходимость демультиплексирования, начиная с ячейки A18 - название образцов, с ячейки F18 - последовательность индекса 1, с ячейки H18 - последовательность индекса 2. Перед загрузкой сканируют штрих-код ячейки, который отображается на сенсорной панели. Перед загрузкой в прибор ячейку предварительно протирают в одном направлении безворсовой салфеткой, пропитанной 96% этанолом. В отсек для реагентов загружают картридж (блок A или блок B). Картридж предварительно встряхивают, чтобы перемешать реагенты, и удалить крышку с пробирки исследуемого образца. Сканируют штрих-код картриджа. После нажатия кнопки "начало" запускают процесс секвенирования. На сенсорной панели прибора отображается время секвенирования, количество пройденных циклов, загрузка ячейки кластерами, шкала с качеством секвенируемых данных Q30. По окончанию процесса секвенирования прибор промывают.