III. Требования к проведению исследований и показатели (условия) безопасности ГИМР

10. Требования к проведению исследований и показатели (условия) безопасности ГИМР:

а) токсикологические исследования ГИМР на лабораторных животных с изучением репродуктивной токсичности должны проводиться на двух поколениях крыс линии Вистар в течение 180 календарных дней.

Токсикологические исследования ГИМР на лабораторных животных с изучением репродуктивной токсичности должны включать изучение репродуктивной функции крыс поколения F0, изучение эмбриотоксического и тератогенного действий, регистрируемых в пре- и постнатальном периодах развития потомства поколения F1, а также оценку физиолого-биохимических показателей крыс поколения F0, F1. Эксперимент проводится на самцах и самках крыс (исходный возраст - 25 - 30 дней). Животные должны быть разделены на 2 равные группы: группа "контроль" и группа "опыт". Группа "контроль" должна получать рацион с включением исходного организма-реципиента; группа "опыт" должна получать рацион с включением исследуемого ГИМР. Обе группы животных должны получать одинаковый по объему и составу рацион, за исключением включенного исследуемого ГИМР или исходного организма-реципиента. Исследуемый ГИМР и исходный организм-реципиент должен быть включен в состав корма в равном количестве. Количество животных в группах в начале эксперимента должно составлять 55 самок и 25 самцов. Животные должны иметь доступ к корму и воде; содержаться в помещении с системой отопления и регулируемым микроклиматом.

Должны оцениваться показатели состояния животных:

общее состояние животных (внешний вид, двигательная активность, состояние шерстного покрова) - каждые 2 календарных дня; поедаемость корма - ежедневно; масса тела - каждые 7 календарных дней;

гематологические показатели крови: концентрация гемоглобина; гематокрит; общее количество эритроцитов; средний объем эритроцита (СОЭ); среднее содержание гемоглобина в эритроците (ССЭ); средняя концентрация гемоглобина в эритроците (СКЭ); общее количество тромбоцитов; общее количество лейкоцитов; дифференцированный подсчет лейкоцитов (нейтрофилы, лимфоциты, эозинофилы, моноциты, базофилы);

биохимические показатели крови: аланинаминотрансфераза (АЛТ); аспартатаминотрансфераза (АСТ); желчные кислоты; фосфатаза щелочная; билирубин общий; билирубин прямой; белок общий; альбумин; глобулин; креатинин; глюкоза; альфа-амилаза; липаза; лактатдегидрогеназа; общие липиды; триглицериды; холестерин; холинэстераза; мочевина; хлориды; натрий; фосфор; калий;

общий анализ мочи: цвет и прозрачность; относительная плотность; pH; белок; глюкоза; креатинин.

Исследование гематологических и биохимических показателей крови, персистенции и показателей мочи должны проводиться на 90-й календарный день опыта у половины животных из каждой группы. По окончании восстановительного периода (10-й календарный день со дня окончания дачи рациона с ГИМР, 101-й календарный день опыта) должны проводиться те же исследования у второй половины животных каждой группы.

На 90-й и 180-й календарные дни эксперимента (плановый забой 15 крыс на группу) должны выполняться макроскопические и микроскопические исследования, обзорные гистологические исследования, морфометрический анализ, определения массы внутренних органов (головного мозга, сердца, селезенки, легких, тимуса, гипофиза, печени, почек, надпочечников, матки, яичников и семенников). Для погибших в течение эксперимента животных должны проводиться морфологические исследования кожи, головного мозга, сердца, аорты, селезенки, легких. В случае если невозможно установить причину смерти, дополнительно должны проводиться морфологические исследования лимфатических узлов, тимуса, щитовидной железы, гипофиза, желудка, тонкой и толстой кишки, печени.

Токсикологические исследования ГИМР на лабораторных животных с изучением репродуктивной токсичности на двух поколениях крыс линии Вистар (F0 и F1) должны быть продолжены на третьем поколении (F2) и четвертом поколении (F3) указанных лабораторных животных в случаях, если:

в результатах исследований между группой "опыт" и группой "контроль" наблюдаются различия в диапазоне между погрешностью эксперимента и величиной двукратной погрешности (статистически значимое различие) по исследуемым показателям;

между группой "опыт" и группой "контроль" наблюдаются различия по следующим показателям: пигментация, отклонение в поведении, появление нехарактерных физиологических, анатомических, биохимических признаков;

в процессе проведения экспертизы (исследования) получены данные из научных источников о негативном влиянии исследуемого ГИМР на окружающую среду.

Скармливание животным рациона, содержащего ГИМР, не должно вызывать клинических изменений (показатели крови, мочи, общего состояния животных, персистенции и выделения ГИМР не должны отклоняться от показателей группы "контроль"), не должны выявляться патологоанатомические изменения при вскрытии;

б) аллергологические исследования ГИМР на лабораторных животных должны проводиться на крысах линии Вистар. Животные должны быть разделены на 2 равные группы: группа "контроль" и группа "опыт". Группа "контроль" должна получать рацион с включением исходного организма-реципиента; группа "опыт" должна получать рацион с включением исследуемого ГИМР. Обе группы животных должны получать одинаковый по объему и составу рацион, за исключением включенного исследуемого ГИМР или исходного организма-реципиента. Исследуемый ГИМР и исходный организм-реципиент должен быть включен в состав корма в равном количестве. Рацион не должен содержать яичный белок. Животные должны иметь доступ к корму и воде; содержаться в помещении с системой отопления и регулируемым микроклиматом.

На 1-й, 3-й, 5-й календарный день опыта крысам внутрибрюшинно должен вводиться пищевой антиген - овальбумин куриного яйца (далее - ОВА), а на 21-й календарный день эксперимента должна вводиться доза ОВА, уменьшенная в 10 раз в сравнении с дозами, введенными ранее. Кормление рационами необходимо продолжать до 29-го календарного дня эксперимента и, затем необходимо ввести внутривенно ОВА, после чего должны быть оценена на протяжении 24 часов тяжесть развивающейся реакции анафилаксии по величине анафилактического индекса. Непосредственно перед внутривенным введением разрешающей дозы у крыс должна отбираться кровь в количестве 0,1 - 0,2 мл из хвостовой вены для иммуноферментного определения уровня специфических антител к ОВА.

Тяжесть реакции анафилактического шока в каждой из групп животных должна оцениваться по анафилактическому индексу, учитывающему тяжесть реакции анафилаксии, и проценту летальных реакций анафилаксии.

Вычисление анафилактического индекса должно проводиться по формуле:

,

где:

N - число животных, у которых наступила смерть;

N1 - число животных, у которых развился тяжелый анафилактический шок (асфиксия, общие судороги, при которых животное теряет способность удерживаться на лапах, не погибает);

N2 - число животных, у которых развился умеренный анафилактический шок (судороги, при которых животное не теряет способность удерживаться на лапах, бронхоспазм);

N3 - число животных, у которых развился слабый анафилактический шок (беспокойство, учащенное дыхание, почесывание мордочки, непроизвольное мочеиспускание, дефекация, шерсть взъерошена);

N4 - животные, у которых анафилактический шок не наступил.

Анафилактический индекс и процент летальных реакций анафилаксии группы "опыт" не должен превышать анафилактический индекс и процент летальных реакций анафилаксии группы "контроль". Уровень антител к ОВА у группы "опыт" не должен отличаться от уровня антител к ОВА группы "контроль";

в) исследование стабильности генетического материала ГИМР должно осуществляться путем пассирования исследуемых ГИМР на жидких и плотных питательных средах с тестированием фенотипических (биохимических) свойств через шесть последовательных пассажей. Молекулярно-генетическими методами должен исследоваться исходный генетический материал ГИМР и генетический материал ГИМР после шестикратного пассирования. Стабильными являются ГИМР, не изменившие фенотипических (биохимических) свойств и сохранившие генетическую структуру после проведения шестикратного пассирования. ГИМР должны демонстрировать стабильность фенотипических (биохимических) свойств и генетической структуры;

г) исследование способности передачи генетического материала ГИМР в потенциальную принимающую среду должно проводиться в течение 3 вегетативных периодов не менее, чем на 8 опытных полях, или в течение меньшего числа вегетативных периодов (1 или 2 по данным заявителя), если заявителем указана нестабильность генетического материла ГИМР в течение менее 3 вегетативных периодов. Для проведения исследования способности передачи генетического материала ГИМР в потенциальную принимающую среду опытные поля должны засеваться в равном количестве ГИМР, исходным организмом-реципиентом и не генно-инженерно-модифицированным растением родственного вида (одно опытное поле может быть засеяно одним видом не генно-инженерно-модифицированного растения), сведения о котором представлены заявителем в соответствии с подпунктом "д" пункта 6 настоящей Методики. ГИМР считаются способными передавать генетический материал в потенциальную окружающую среду при выявлении потомства ГИМР. ГИМР не должны иметь способность передачи генетического материала в потенциальную принимающую среду;

д) исследование жизнестойкости ГИМР на объектах окружающей среды, в том числе после термической обработки должно проводиться с использованием питательных сред, культур клеток или иных тест-объектов, чувствительных к исходному организму-реципиенту, согласно информации, представленной заявителем в соответствии с подпунктом "б" пункта 6 настоящей Методики. Эксперименты должны проводиться с использованием в качестве контроля исходного организма-реципиента. Условия экспериментов для исходного организма-реципиента и ГИМР должны совпадать. Жизнестойкость ГИМР в окружающей среде не должна превышать жизнестойкость исходного организма-реципиента;

е) исследование инвазивности ГИМР должно проводиться на 8 опытных полях в течение 3 вегетативных периодов. Для проведения исследования инвазивности ГИМР опытные поля делятся на 2 равные группы "контроль" и "опыт". В первый вегетативный период опытные поля группы "опыт" засеваются ГИМР, опытные поля группы "контроль" засеваются исходным организмом-реципиентом в равном количестве. Во второй и третий вегетативные периоды опытные поля группы "контроль" и группы "опыт" засеваются в равном количестве не генно-инженерно-модифицированными растениями родственных видов (одно опытное поле может быть засеяно одним видом не генно-инженерно-модифицированного растения), сведения о которых представлены заявителем в соответствии с подпунктом "д" пункта 6 настоящей Методики.

Условия культивирования для исходного организма-реципиента и ГИМР должны совпадать. По истечении третьего вегетативного периода проводится анализ всхожести не генно-инженерно-модифицированных растений родственных видов на опытных полях группы "контроль" и группы "опыт", а также по периметру 300 метров вокруг указанных опытных полей. ГИМР считается инвазивным, если количество взошедших не генно-инженерно-модифицированных растений родственных видов на опытных полях группы "контроль" и по периметру 300 метров вокруг них превышает количество указанных взошедших растений на опытных полях группы "опыт" и по периметру 300 метров вокруг них. ГИМР не должны быть инвазивными.

11. Исследования ГИМР на опытных полях, предусмотренные подпунктами "г", "е" пункта 10 настоящей Методики, должны проводиться с одновременным применением следующих мер безопасности:

а) пространственная изоляция опытных полей от родственных видов сельскохозяйственных растений: для ветроопыляемых культур - не менее 800 метров; для насекомоопыляемых культур - не менее 1500 метров; для самоопыляемых культур - не менее 50 метров; для вегетативно-размножающихся культур - не менее 5 метров;

б) защитные посевы растений того же вида вокруг опытных полей: для пропашных культур не менее 4 рядов; для плодовых, ягодных, древесных декоративных и лесных культур - не менее 1 ряда; для культур сплошного сева не менее 3,6 метров;

в) размещение опытных полей на расстоянии не менее 500 метров от населенных пунктов и береговых линий поверхностных водных объектов <2>;

--------------------------------

<2> Части 2 - 4 статьи 5 Водного кодекса Российской Федерации (Собрание законодательства Российской Федерации, 2006, N 23, ст. 2381).

г) размещение опытных полей на расстоянии не менее 1500 метров от границ особо охраняемых природных территорий <3>, лечебно-оздоровительных местностей и курортов <4>.

--------------------------------

<3> Пункты 2, 3 статьи 2 Федерального закона от 14 марта 1995 г. N 33-ФЗ "Об особо охраняемых природных территориях" (Собрание законодательства Российской Федерации, 1995, N 12, ст. 1024; 2013, N 52, ст. 6971).

<4> Пункт 1 статьи 3 Федерального закона от 23 февраля 1995 г. N 26-ФЗ "О природных лечебных ресурсах, лечебно-оздоровительных местностях и курортах" (Собрание законодательства Российской Федерации, 1995, N 9, ст. 713; 2008, N 30, ст. 3616).