Главная
Документы
V. ПЦР С ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ

Постановление Главного государственного санитарного врача РФ от 30.11.2007 N 80 "О надзоре за оборотом пищевых продуктов, содержащих ГМО" (вместе с "МУ 2.3.2.2306-07. 23.2. Пищевые продукты и пищевые добавки. Медико-биологическая оценка безопасности...

V. ПЦР С ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ

5.1. Идентификация видоспецифичной растительной ДНК.

5.1.1. Идентификация ДНК сои, ген лектина:

- праймеры:

1) 5' GCC CTC TAC TCC ACC CCC ATC C 3';

2) 5' GCC CAT CTG CAA GCC TTT TTG TG 3';

- реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:

┌──────────────────────────────────────┬──────────────────────────────────┐

│ Реактивы │ Объем, мкл │

├──────────────────────────────────────┼──────────────────────────────────┤

│Деионизированная вода │193,70 │

│Буфер для ПЦР с MgCl2 (10x) │ 25,00 │

│Смесь нуклеотидов (4 млМ) │ 12,50 │

│Праймер 1 (20 мкМ) │ 6,25 │

│Праймер 2 (20 мкМ) │ 6,25 │

│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 1,30 │

└──────────────────────────────────────┴──────────────────────────────────┘

- реакционную смесь перемешать на вортекс, центрифугировать 30 секунд при 3000 об./мин., разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,0 мкл в каждую, добавить 1,0 мкл раствора ДНК в каждую пробирку, перемешать, центрифугировать 30 секунд при 3000 об./мин., при использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла;

- условия амплификации:

┌────────────────────────────────┬────────────────────────────────────────┐

│ Стадия │ Программа амплификации │

├────────────────────────────────┼────────────────────────────────────────┤

│Денатурация │3 мин./95 °C │

│Амплификация │30 сек./95 °C, 30 сек./60 °C, │

│ │40 сек./72 °C │

│Количество циклов амплификации │40 │

│Конечное удлинение │3 мин./72 °C │

│Фаза остывания │4 °C │

└────────────────────────────────┴────────────────────────────────────────┘

- после проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации - 118 пар нуклеотидов, приложение 2.1.

5.1.2. Идентификация ДНК кукурузы, ген зеина:

- праймеры:

1) 5' TGC TTG CAT TGT TCG CTC TCC TAG 3';

2) 5' GTC GCA GTG ACA TTG TGG CAT 3';

- реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:

│ Реактивы │ Объем, мкл │

│Деионизированная вода │193,70 │

│Буфер для ПЦР с MgCl2 (10x) │ 25,00 │

│Смесь нуклеотидов (4 мМ) │ 12,50 │

│Праймер 1 (20 мкМ) │ 6,25 │

│Праймер 2 (20 мкМ) │ 6,25 │

│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 1,30 │

- условия амплификации:

│ Стадия │ Программа амплификации │

│Денатурация │3 мин./95 °C │

│Амплификация │1 мин./94 °C, 1 мин./60 °C, 1 мин./72 °C│

│Количество циклов амплификации │40 │

│Конечное удлинение │7 мин./72 °C │

│Фаза остывания │4 °C │

- после проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации - 329 пар нуклеотидов, приложение 2.2.

5.1.3. Идентификация ДНК картофеля, ген фосфоенолпируват карбоксилазы:

- праймеры:

1) 5' GTC TCC TTG GCT TGT CAT TTT ATG C 3';

2) 5' CAA GTT AGC TGC CAT CAT TCT GGC C 3';

- реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:

│ Реактивы │ Объем, мкл │

│Деионизированная вода │188,70 │

│Буфер для ПЦР с MgCl2 (10x) │ 25,00 │

│Смесь нуклеотидов (4 млМ) │ 12,50 │

│Праймер 1 (20 мкМ) │ 6,25 │

│Праймер 2 (20 мкМ) │ 6,25 │

│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 1,30 │

- реакционную смесь перемешать на вортекс и центрифугировать 30 секунд при 3000 об./мин., разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,0 мкл в каждую, добавить 1,0 мкл раствора ДНК в каждую пробирку, перемешать, центрифугировать 30 секунд при 3000 об./мин., при использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла;

- условия амплификации:

│ Стадия │ Программа амплификации │

│Денатурация │3 мин./95 °C │

│Амплификация │1 мин./94 °C, 1 мин./60 °C, 1 мин./72 °C│

│Количество циклов амплификации │40 │

│Конечное удлинение │7 мин./72 °C │

│Фаза остывания │4 °C │

- после проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации - 1149 пар нуклеотидов, приложение 2.3.

5.2. Скриниговый анализ.

5.2.1. Метод идентификации промотора 35 S:

- праймеры:

1) 5' GCT CCT ACA AAT GCC ATC A 3';

2) 5' GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA 3';

- реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:

│ Реактивы │ Объем, мкл │

│Деионизированная вода │169,0 │

│Буфер для ПЦР с MgCl2 (10x) │ 29,0 │

│Раствор БСА (20 мкг/мл) │ 29,0 │

│Смесь нуклеотидов (4 млМ) │ 14,0 │

│Праймер 1 (20 мкМ) │ 7,0 │

│Праймер 2 (20 мкМ) │ 7,0 │

│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 1,5 │

- условия амплификации:

│ Стадия │ Программа амплификации │

│Денатурация │3 мин./94 °C │

│Амплификация │20 сек./94 °C, 40 сек./54 °C, │

│ │60 сек./72 °C │

│Количество циклов амплификации │40 │

│Конечное удлинение │3 мин./72 °C │

│Фаза остывания │1 мин./4 °C │

│Скорость нагрева │0,77 °C/сек. │

│Скорость остывания │3,15 °C/сек. │

- после проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации - 195 пар нуклеотидов, приложение 2.4.

5.2.2. Метод идентификации терминатора NOS:

- праймеры:

1) 5' GAA TCC TGT TGC CGG TCT TG 3';

2) 5' TTA TCC TAG TTT GCG CGC TA 3';

- реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:

│ Реактивы │ Объем, мкл │

│Деионизированная вода │169,0 │

│Буфер для ПЦР с MgCl2 (10x) │ 29,0 │

│Раствор БСА (20 мкг/мл) │ 29,0 │

│Смесь нуклеотидов (4 млМ) │ 14,0 │

│Праймер 1 (20 мкМ) │ 7,0 │

│Праймер 2 (20 мкМ) │ 7,0 │

│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 1,5 │

- условия амплификации:

│ Стадия │ Программа амплификации │

│Денатурация │3 мин./94 °C │

│Амплификация │20 сек./94 °C, 40 сек./54 °C, │

│ │60 сек./72 °C │

│Количество циклов амплификации │40 │

│Конечное удлинение │3 мин./72 °C │

│Фаза остывания │1 мин./4 °C │

- после проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации - 180 пар нуклеотидов, приложение 2.5.

5.2.3. Метод идентификации маркерного гена npt II:

- праймеры:

1) 5' GGA TCT CCT GCT ATC T 3';

2) 5' GAT CAT CCT GAT CGA C 3';

- реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:

│ Реактивы │ Объем, мкл │

│Деионизированная вода │16,53 │

│Буфер для ПЦР с MgCl2 (10x) │ 3,30 │

│Раствор БСА (20 мкг/мл) │ 3,30 │

│Смесь нуклеотидов (4 млМ) │ 0,62 │

│Праймер 1 (32 пикомоль/мкл) │ 0,40 │

│Праймер 2 (59 пикомоль/мкл) │ 0,20 │

│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 0,15 │

- реакционную смесь перемешать на вортекс и центрифугировать 30 секунд при 3000 об./мин., разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,0 мкл в каждую, добавить 1,0 мкл раствора ДНК в каждую пробирку, перемешать, центрифугировать 30 секунд при 3000 об./мин., при использовании амилификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла;

- условия амплификации:

│ Стадия │ Программа амплификации │

│Денатурация │3 мин./94 °C │

│Амплификация │30 сек./95 °C, 50 сек./50 °C, │

│ │40 сек./72 °C │

│Количество циклов амплификации │40 │

│Конечное удлинение │3 мин./72 °C │

│Фаза остывания │4 °C │

- после проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации - 173 пары нуклеотидов, приложение 2.6.

5.3. Идентификация линий ГМО.

5.3.1. Метод идентификации сои линии 40-3-2:

- 1-й раунд, внешние праймеры:

1) 5'CCA CTG ACG TAA GGG ATG ACG 3';

2) 5'CAT GAA GGA CCG GTG GGA GAT 3';

- реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:

│ Реактивы │ Объем, мкл │

│Деионизированная вода │188,70 │

│Буфер для ПЦР с MgCl2 (10x) │ 25,00 │

│Смесь нуклеотидов (4 млМ) │ 12,50 │

│Праймер 1 (20 мкМ) │ 6,25 │

│Праймер 2 (20 мкМ) │ 6,25 │

│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 1,30 │

- условия амплификации:

│ Стадия │ Программа амплификации │

│Денатурация │3 мин./95 °C │

│Амплификация │30 сек./95 °C, 30 сек./60 °C, │

│ │40 сек./72 °C │

│Количество циклов амплификации │25 │

│Конечное удлинение │3 мин./72 °C │

│Фаза остывания │4 °C │

- после проведения амплификации пробы поместить на холод, хранение не более одного часа в холодильнике до проведения 2-го раунда;

- 2-й раунд, внутренние праймеры:

3) 5' ATC CCA CTA TCC TTC GCA AGA 3';

4) 5' TGG GGT TTA TGG AAA TTG GAA 3';

- реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:

│ Реактивы │ Объем, мкл │

│Деионизированная вода │193,70 │

│Буфер для ПЦР с MgCl2 (10x) │ 25,00 │

│Смесь нуклеотидов (4 млМ) │ 12,50 │

│Праймер 3 (20 мкМ) │ 6,25 │

│Праймер 4 (20 мкМ) │ 6,25 │

│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 1,30 │

- реакционную смесь перемешать на вортекс, центрифугировать 30 секунд при 3000 об./мин., разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,5 мкл в каждую, добавить 0,5 мкл раствора ДНК в каждую пробирку, перемешать, центрифугировать 30 секунд при 3000 об./мин., при использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла;

- условия амплификации:

│ Стадия │ Программа амплификации │

│Денатурация │3 мин./95 °C │

│Амплификация │30 сек./95 °C, 30 сек./60 °C, │

│ │40 сек./72 °C │

│Количество циклов амплификации │35 │

│Конечное удлинение │3 мин./72 °C │

│Фаза остывания │4 °C │

- после проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза, продукт амплификации 169 пар нуклеотидов, приложение 2.7.

5.3.2. Метод идентификации сои линии A2704-12:

- праймеры:

1) 5' GGC GTT CGT AGT GAC TGA GG 3';

2) 5' GTT TTA CAA CGT CGT GAC TGG 3';

- реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:

│ Реактивы │ Объем, мкл │

│Деионизированная вода │169,0 │

│Буфер для ПЦР с MgCl2 (10x) │ 29,0 │

│Раствор БСА (20 мкг/мл) │ 29,0 │

│Смесь нуклеотидов (4 млМ) │ 14,0 │

│Праймер 1 (20 мкМ) │ 7,0 │

│Праймер 2 (20 мкМ) │ 7,0 │

│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 1,5 │

- условия амплификации:

│ Стадия │ Программа амплификации │

│Денатурация │3 мин./94 °C │

│Амплификация │20 сек./94 °C, 40 сек./54 °C, │

│ │60 сек./72 °C │

│Количество циклов амплификации │40 │

│Конечное удлинение │3 мин./72 °C │

│Фаза остывания │4 °C │

- после проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации - 185 пар нуклеотидов, приложение 2.8.

5.3.3. Метод идентификации сои линии А5547-127.

- праймеры:

1) 5' TGT GGT TAT GGC GGT GCC ATC 3';

2) 5' TGC TAC AGG CAT CGT GGT GTC 3';

- реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:

│ Реактивы │ Объем, мкл │

│Деионизированная вода │169,0 │

│Буфер для ПЦР с MgCl2 (10x) │ 29,0 │

│Раствор БСА (20 мкг/мл) │ 29,0 │

│Смесь нуклеотидов (4 млМ) │ 14,0 │

│Праймер 1 (20 мкМ) │ 7,0 │

│Праймер 2 (20 мкМ) │ 7,0 │

│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 1,5 │

- условия амплификации:

│ Стадия │ Программа амплификации │

│Денатурация │3 мин./94 °C │

│Амплификация │20 сек./94 °C, 40 сек./54 °C, │

│ │60 сек./72 °C │

│Количество циклов амплификации │40 │

│Конечное удлинение │3 мин./72 °C │

│Фаза остывания │4 °C │

- после проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации - 150 пар нуклеотидов, приложение 2.9.

5.3.4. Метод идентификации кукурузы линии Bt 176:

- 1-й раунд, внешние праймеры:

1) 5' CGG CCC CGA GTT CAC CTT 3';

2) 5' CTG CTG GGG ATG ATG TTG TTG 3';

- реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:

│ Реактивы │ Объем, мкл │

│Деионизированная вода │188,70 │

│Буфер для ПЦР с MgCl2 (10x) │ 25,00 │

│Смесь нуклеотидов (4 млМ) │ 12,50 │

│Праймер 1 (20 мкМ) │ 6,25 │

│Праймер 2 (20 мкМ) │ 6,25 │

│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 1,30 │

- условия амплификации:

│ Стадия │ Программа амплификации │

│Денатурация │3 мин./95 °C │

│Амплификация │40 сек./95 °C, 40 сек./60 °C, │

│ │40 сек./72 °C │

│Количество циклов амплификации │25 │

│Конечное удлинение │3 мин./72 °C │

│Фаза остывания │4 °C │

- 2-й раунд, внутренние праймеры:

3) 5' CCG CAC CCT GAG CAG CAC 3';

4) 5' GGT GGC ACG TTG TTG TTC TGA 3';

- реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:

│ Реактивы │ Объем, мкл │

│Деионизированная вода │193,70 │

│Буфер для ПЦР с MgCl2 (10x) │ 25,00 │

│Смесь нуклеотидов (4 млМ) │ 12,50 │

│Праймер 3 (20 мкМ) │ 6,25 │

│Праймер 4 (20 мкМ) │ 6,25 │

│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 1,30 │

- условия амплификации:

│ Стадия │ Программа амплификации │

│Денатурация │3 мин./95 °C │

│Амплификация │40 сек./95 °C, 40 сек./60 °C, │

│ │40 сек./72 °C │

│Количество циклов амплификации │35 │

│Конечное удлинение │3 мин./72 °C │

│Фаза остывания │4 °C │

- после проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации - 189 пар нуклеотидов, приложение 2.10.

5.3.5. Метод идентификации линии MON 810:

- 1-й раунд, внешние праймеры:

1) 5' TAT CTC CAC TGA CGT AAG GGA TGA C 3';

2) 5' TGC CCT ATA ACA CCA ACA TGT GCT T 3';

- реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:

│ Реактивы │ Объем, мкл │

│Деионизированная вода │188,70 │

│Буфер для ПЦР с MgCl2 (10x) │ 25,00 │

│Смесь нуклеотидов (4 млМ) │ 12,50 │

│Праймер 1 (20 мкМ) │ 6,25 │

│Праймер 2 (20 мкМ) │ 6,25 │

│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 1,30 │

- условия амплификации:

│ Стадия │ Программа амплификации │

│Денатурация │3 мин./95 °C │

│Амплификация │45 сек./95 °C, 50 сек./60 °C, │

│ │50 сек./72 °C │

│Количество циклов амплификации │35 │

│Конечное удлинение │3 мин./72 °C │

│Фаза остывания │4 °C │

- 2-й раунд, внутренние праймеры:

3) 5' ACT ATC CTT CGC AAG ACC CTT CCTC 3';

4) 5' GCA TTC AGA GAA ACG TGG CAG TAA C 3';

- реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:

│ Реактивы │ Объем, мкл │

│Деионизированная вода │193,70 │

│Буфер для ПЦР с MgCl2 (10x) │ 25,00 │

│Смесь нуклеотидов (4 млМ) │ 12,50 │

│Праймер 3 (20 мкМ) │ 6,25 │

│Праймер 4 (20 мкМ) │ 6,25 │

│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 1,30 │

- реакционную смесь перемешать на вортекс и центрифугировать 30 секунд при 3000 об./мин., разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,5 мкл в каждую, добавить 0,5 мкл раствора ДНК в каждую пробирку, перемешать, центрифугировать (30 секунд при 3000 об./мин.), при использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла;

- условия амплификации:

│ Стадия │ Программа амплификации │

│Денатурация │3 мин./95 °C │

│Амплификация │45 сек./95 °C, 50 сек./60 °C, │

│ │50 сек./72 °C │

│Количество циклов амплификации │40 │

│Конечное удлинение │3 мин./72 °C │

│Фаза остывания │4 °C │

- после проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации - 149 пар нуклеотидов, приложение 2.11.

5.3.6. Метод идентификации кукурузы линии MON 863:

- праймеры:

1) 5' GTA GGA TCG GAA AGC TTG GTA C 3';

2) 5' TGT TAC GGC CTA AAT GCT GAA CT 3';

- реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:

│ Реактивы │ Объем, мкл │

│Деионизированная вода │169,0 │

│Буфер для ПЦР с MgCl2 (10x) │ 29,0 │

│Раствор БСА (20 мкг/мл) │ 29,0 │

│Смесь нуклеотидов (4 млМ) │ 14,0 │

│Праймер 1 (20 мкМ) │ 7,0 │

│Праймер 2 (20 мкМ) │ 7,0 │

│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 1,5 │

- реакционную смесь перемещать на вортекс и центрифугировать 30 секунд при 3000 об./мин., разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,0 мкл в каждую, добавить 1,0 мкл раствора ДНК в каждую пробирку, перемешать, центрифугировать 30 секунд при 3000 об./мин., при использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла;

- условия амплификации:

│ Стадия │ Программа амплификации │

│Денатурация │3 мин./94 °C │

│Амплификация │20 сек./94 °C, 40 сек./54 °C, │

│ │60 сек./72 °C │

│Количество циклов амплификации │40 │

│Конечное удлинение │3 мин./72 °C │

│Фаза остывания │1 мин. - 4 °C │

- после проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации 84 пары нуклеотидов, приложение 2.12.

5.3.7. Метод идентификации кукурузы линии NK 603:

- праймеры:

1) 5' AGT AAT GAC CTC GAG TAA GCT TGT TAA 3';

2) 5' AAG AGA TAA CGA GAT CCA CTC AAA CAC T 3';

- реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:

│ Реактивы │ Объем, мкл │

│Деионизированная вода │169,0 │

│Буфер для ПЦР с MgCl2 (10x) │ 29,0 │

│Раствор БСА (20 мкг/мл) │ 29,0 │

│Смесь нуклеотидов (4 млМ) │ 14,0 │

│Праймер 1 (20 мкМ) │ 7,0 │

│Праймер 2 (20 мкМ) │ 7,0 │

│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 1,5 │

- условия амплификации:

│ Стадия │ Программа амплификации │

│Денатурация │3 мин./94 °C │

│Амплификация │20 сек./94 °C, 40 сек./54 °C, │

│ │60 сек./72 °C │

│Количество циклов амплификации │40 │

│Конечное удлинение │3 мин./72 °C │

│Фаза остывания │1 мин. - 4 °C │

- после проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации - 108 пар нуклеотидов, приложение 2.13.

5.3.8. Метод идентификации кукурузы линии Bt 11:

- праймеры:

1) 5' CCA TTT TTC AGC TAG GAA GTT C 3';

2) 5' TCG TTG ATG TTK GGG TTG TTG TCC 3';

- реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:

│ Реактивы │ Объем, мкл │

│Деионизированная вода │169,0 │

│Буфер для ПЦР с MgCl2 (10x) │ 29,0 │

│Раствор БСА (20 мкг/мл) │ 29,0 │

│Смесь нуклеотидов (4 млМ) │ 14,0 │

│Праймер 1 (20 мкМ) │ 7,0 │

│Праймер 2 (20 мкМ) │ 7,0 │

│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 1,5 │

- условия амплификации:

│ Стадия │ Программа амплификации │

│Денатурация │10 мин./95 °C │

│Амплификация │30 сек./95 °C, 60 сек./63 °C, │

│ │60 сек./72 °C │

│Количество циклов амплификации │10 │

│Амплификация │30 сек./95 °C, 30 сек./60 °C, │

│ │30 сек./95 °C │

│Количество циклов амплификации │30 │

│Конечное удлинение │7 мин./72 °C │

│Фаза остывания │1 мин. - 4 °C │

- после проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации - 110 пар нуклеотидов, приложение 2.14.

5.3.9. Метод идентификации кукурузы T 25:

- праймеры:

1) 5' GCC AGT TAG GCC AGT TAC CCA 3';

2) 5' TGA GCG AAA CCC TAT AAG AAC CCT 3';

- реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:

│ Реактивы │ Объем, мкл │

│Деионизированная вода │169,0 │

│Буфер для ПЦР с MgCl2 (10x) │ 29,0 │

│Раствор БСА (20 мкг/мл) │ 29,0 │

│Смесь нуклеотидов (4 млМ) │ 14,0 │

│Праймер 1 (20 мкМ) │ 7,0 │

│Праймер 2 (20 мкМ) │ 7,0 │

│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 1,5 │

- условия амплификации:

│ Стадия │ Программа амплификации │

│Денатурация │10 мин./95 °C │

│Амплификация │30 сек./95 °C, 60 сек./63 °C, │

│ │60 сек./72 °C │

│Количество циклов амплификации │10 │

│Амплификация │30 сек./95 °C, 30 сек./60 °C, │

│ │30 сек./95 °C │

│Количество циклов амплификации │30 │

│Конечное удлинение │7 мин./72 °C │

│Фаза остывания │1 мин. - 4 °C │

- после проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации - 149 пар нуклеотидов, приложение 2.15.

5.3.10. Метод идентификации кукурузы линии GA 21:

- праймеры:

1) 5' ACG GTG GAA GAG TTC AAT GTA TG 3';

2) 5' TCT CCT TGA TGG GCT GCA 3';

- реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:

│ Реактивы │ Объем, мкл │

│Деионизированная вода │169,0 │

│Буфер для ПЦР с MgCl2 (10x) │ 29,0 │

│Раствор БСА (20 мкг/мл) │ 29,0 │

│Смесь нуклеотидов (4 млМ) │ 14,0 │

│Праймер 1 (20 мкМ) │ 7,0 │

│Праймер 2 (20 мкМ) │ 7,0 │

│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 1,5 │

- условия амплификации:

│ Стадия │ Программа амплификации │

│Денатурация │3 мин./94 °C │

│Амплификация │20 сек./94 °C, 40 сек./54 °C, │

│ │60 сек./72 °C │

│Количество циклов амплификации │40 │

│Конечное удлинение │3 мин./72 °C │

│Фаза остывания │1 мин. - 4 °C │

- после проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации - 270 пар нуклеотидов, приложение 2.16.

5.3.11. Метод идентификации кукурузы линии MIR 604:

- праймеры:

1) 5' GGT ACC CAT TTG GCG CCG AT 3';

2) 5' CAG CGT TGC GGT TCT GTC AG 3';

- реакционная смесь для проведения ПЦР:

│ Реактивы │ Объем, мкл │

│Раствор ДНК │ 0,5 │

│Праймер 1 (20 мкМ) │ 1,0 │

│Праймер 2 (20 мкМ) │ 1,0 │

│Буферная смесь │ 2,5 │

│Taq-полимераза │ 0,2 │

│Деионизированная вода │19,8 │

- состав буферной смеси:

┌────────────────────────────────────┬────────────────────────────────────┐

│ Реактивы │ Объем, мкл │

├────────────────────────────────────┼────────────────────────────────────┤

│1 M KCL │500 │

│100 мМ dATP │ 20 │

│100 мМ dCTP │ 20 │

│100 мМ dTTP │ 20 │

│100 мМ dGTP │ 20 │

│100 мМ MgC2 │150 │

│Деионизированная вода │170 │

│1 М Tris-HCl-pH 8,3 │100 │

└────────────────────────────────────┴────────────────────────────────────┘

- условия амплификации:

│ Стадия │ Программа амплификации │

│Денатурация │4 мин./94 °C │

│Амплификация │30 сек./95 °C, 30 сек./55 °C, │

│ │2 мин./72 °C │

│Количество циклов амплификации │34 │

│Конечное удлинение │5 мин./72 °C │

│Фаза остывания │до конца/4 °C │

- после проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации - 895 пар нуклеотидов, приложение 2.17.

5.3.12. Метод идентификации кукурузы линии MON 88017:

- праймеры:

1) 5' GAG CAG GAC CTG CAG AAG CT 3';

2) 5' TCC GGA GTT GAC CAT CCA 3';

- реакционная смесь для проведения ПЦР:

│ Реактивы │ Объем, мкл │

│Раствор ДНК │ 0,5 │

│Праймер 1 (20 мкМ) │ 1,0 │

│Праймер 2 (20 мкМ) │ 1,0 │

│Буферная смесь │ 2,5 │

│Taq-полимераза │ 0,2 │

│Деионизированная вода │19,8 │

- состав буферной смеси:

│ Реактивы │ Объем, мкл │

│1 M KCL │500 │

│100 мМ dATP │ 20 │

│100 мМ dCTP │ 20 │

│100 мМ dTTP │ 20 │

│100 мМ dGTP │ 20 │

│100 мМ MgC2 │150 │

│Деионизированная вода │170 │

│1 М Tris-HCl-pH 8,3 │100 │

- условия амплификации:

│ Стадия │ Программа амплификации │

│Денатурация │4 мин./94 °C │

│Амплификация │30 сек./95 °C, 30 сек./55 °C, │

│ │2 мин./72 °C │

│Количество циклов амплификации │34 │

│Конечное удлинение │5 мин./72 °C │

│Фаза остывания │до конца/4 °C │

- после проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации - 94 пары нуклеотидов, приложение 2.18.

5.3.13. Метод идентификации сахарной свеклы линии Н7-1:

- праймеры:

1) 5' TGG GAT CTG GGT GGC TCT AAC T 3';

2) 5' AAT GCT GCT AAA TCC TGA G 3';

- реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:

│ Реактивы │ Объем, мкл │

│Деионизированная вода │169,0 │

│Буфер для ПЦР с MgCl2 (10x) │ 29,0 │

│Раствор БСА (20 мкг/мл) │ 29,0 │

│Смесь нуклеотидов (4 млМ) │ 14,0 │

│Праймер 1 (20 мкМ) │ 7,0 │

│Праймер 2 (20 мкМ) │ 7,0 │

│Taq-полимераза (5 единиц/мкл) │ 1,5 │

- условия амплификации:

│ Стадия │ Программа амплификации │

│Денатурация │3 мин./94 °C │

│Амплификация │20 сек./94 °C, 40 сек./54 °C, │

│ │60 сек./72 °C │

│Количество циклов амплификации │40 │

│Конечное удлинение │3 мин./72 °C │

│Фаза остывания │1 мин./4 °C │

- после проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации - 110 пар нуклеотидов, приложение 2.19.

5.3.14. Метод идентификации риса LL 62:

- праймеры:

1) 5' AGC TGG CGT AAT AGC GAA GAG G 3';

2) 5' TGC TAA CGG GTG CAT CGT CTA 3';

- реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:

│ Реактивы │ Объем, мкл │

│Деионизированная вода │169,0 │

│Буфер для ПЦР с MgCl2 (10x) │ 29,0 │

│Раствор БСА (20 мкг/мл) │ 29,0 │

│Смесь нуклеотидов (4 млМ) │ 14,0 │

│Праймер 1 (20 мкМ) │ 7,0 │

│Праймер 2 (20 мкМ) │ 7,0 │

Полный текст документа вы можете просмотреть в коммерческой версии КонсультантПлюс.

IV. Выделение ДНК VI. Проведение электрофореза в агарозном геле