IV. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК

4.1. Метод выделения ДНК с помощью СТАВ:

- навеску исследуемого гомогенизированного продукта массой 100 мг поместить в микроцентрифужную пробирку типа Эппендорф на 1,5 мл;

- добавить 300 мкл деионизированной воды, перемешать шпателем;

- добавить 500 мкл лизирующего СТАВ-буфера с меркаптоэтанолом, тщательно перемешать шпателем;

- инкубировать при 65 °C 90 минут;

- центрифугировать 10 минут при 13000 об./мин.;

- перенести 500 мкл супернатанта в чистую пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 мл;

- добавить 500 мкл хлороформа, перемешать на вортекс 30 секунд;

- центрифугировать 10 минут при 13000 об./мин.;

- перенести 500 мкл верхней фракции в чистую пробирку, добавить 500 мкл хлороформа, перемешать;

- центрифугировать 5 минут при 13000 об./мин.;

- перенести верхнюю фракцию в чистую пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 мл, не захватывая слой хлороформа;

- добавить 2 объема СТАВ-осаждающего буфера, перемешать пипетированием;

- инкубировать 60 минут при комнатной температуре;

- центрифугировать 5 минут при 13000 об./мин.;

- удалить супернатант;

- растворить осадок в 350 мкл NaCl (1,2М);

- добавить 350 мкл хлороформа, перемешать на вортекс 30 секунд;

- центрифугировать 10 минут при 13000 об./мин.;

- перенести верхнюю фракцию в чистую пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 мл;

- добавить 0,6 объема изопропилового спирта, перемешать;

- центрифугировать 10 минут при 13000 об./мин.;

- удалить супернатант;

- добавить 500 мкл 70%-го раствора этилового спирта и перемешать на вортекс;

- центрифугировать 10 минут при 13000 об./мин.;

- удалить супернатант;

- подсушить осадок не более 5 минут при 65 °C для удаления капель спирта;

- растворить осадок в 100 мкл деионизированной воды, осторожно встряхивая, полученный раствор ДНК готов для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР);

- хранить при минус 20 °C.

4.2. Сорбционный метод выделения ДНК:

- в центрифужные пробирки типа Эппендорф на 1,5 мл внести 300 мг бисера и 70 - 80 мг анализируемого материала, добавить 0,5 мл 5 мМ Na2-соль ЭДТА и термостатировать 30 - 60 минут при 65 °C;

- к содержимому пробирки добавить 400 мкл лизирующего реагента, перемешать на вортекс до максимально однородного состояния, термостатировать при 65 °C 60 - 120 минут;

- перемешать на вортекс, добавить 500 мкл бидистиллированной воды, перемешать на вортекс;

- центрифугировать 1 минуту при 12000 об./мин., прозрачный супернатант перенести в чистую пробирку;

- добавить 20 мкл сорбента, пробирку поместить на ротатор или перемешивать на вортекс 10 минут при 10 - 20 об./мин.;

- центрифугировать 10 секунд при 12000 об./мин.;

- удалить супернатант, к осадку добавить 200 мкл лизирующего реагента, перемешать на вортекс до однородного состояния, центрифугировать 10 секунд при 12000 об./мин.;

- удалить супернатант, к осадку добавить 1 мл рабочего раствора солевого буфера, перемешать содержимое пробирки переворачиванием 5 - 10 раз, центрифугировать 10 секунд при 12000 об./мин.;

- удалить супернатант, не задевая осадка;

- к осадку добавить 1 мл рабочего раствора солевого буфера, перемешать на вортекс, центрифугировать 10 секунд при 12000 об./мин., удалить супернатант;

- повторить предыдущий пункт еще раз;

- подсушить осадок при 65 °C в течение 4 - 5 минут:

- к осадку добавить 50 мкл экстракционного раствора, отбор раствора из исходного флакона проводить при постоянном помешивании, не допуская выпадения в осадок гранул ионообменной смолы;

- суспендировать содержимое пробирки на вортекс 5 - 10 секунд до гомогенного состояния, затем термостатировать 10 минут при 65 °C;

- повторно суспендировать пробу на вортекс, центрифугировать 1 минуту при 12000 об./мин.;

- раствор ДНК перенести в чистую пробирку, хранить при минус 20 °C.