Инвазивные методы оценки строения и/или функции ресничек

- Рекомендовано проведение высокоскоростного видео-микроскопического анализа (ВСВМ, HSVA, HSVMA) (Патолого-анатомическое исследование биопсийного (операционного) материала тканей верхних дыхательных путей/Патолого-анатомическое исследование биопсийного (операционного) материала тканей трахеи и бронхов) пациентам с клиническими признаками ПЦД с целью оценки функциональной активности ресничек непосредственно в щеточных биоптатах слизистой носа/бронхов или после культурирования клеток мерцательного эпителия, полученных с помощью биопсии с последующей дифференцировкой в реснитчатые клетки (цилиогенез) (метод ALI-культуры или метод культуры органоидов) с определением частоты биения ресничек - CBF в сочетании с паттерном биения ресничек CBP [3].

(УУР - C, УДД - 5)

Комментарий: метод отличается высокой чувствительностью, но низкой специфичностью; оценка функциональной активности не может производиться изолированно на основе определения частоты биения ресничек.

Самостоятельно не может быть использован ни для подтверждения, ни для исключения диагноза ПЦД; имеет диагностическое значение при использовании совместно с оценкой клинических симптомов и другими специальными методами.

ERS не рекомендует оценивать частоту биений ресничек (CBF) без оценки характера биений ресничек при диагностике ПЦД. Для повышения диагностической точности ВСВМ, оценку CBF следует повторить после культурирования клеток мерцательного эпителия (метод ALI-культуры или метод культуры органоидов).

Возможно применение модифицированного метода световой микроскопии "в темном поле". Компьютеризированная световая микроскопия.

В качестве материала исследования используют щеточные биоптаты слизистой оболочки носа и/или бронхов.

Щеточные биоптаты получают с малоизмененной слизистой оболочки в период ремиссии заболевания. Биоптаты слизистой оболочки незамедлительно после забора помещают в подогретый до 37° C забуференный изотонический раствор натрия хлорида** (натрия хлорид** 0,9%) и немедленно (не более чем через 20 минут) исследуют нативные препараты. Пригодным для исследования является материал, содержащий цельные пласты эпителия (не менее 12 клеток) с минимальной примесью эритроцитов и слизи.

Для оценки биоптатов цилиарного эпителия методом компьютеризированной световой микроскопии используются нативные препараты или видеоклипы движущихся объектов.

Параметрирование объектов производится в соответствии с алгоритмами, разработанными производителем программы "Мастер Морфология". Параметры движения ресничек предпочтительнее измерять на AVI-изображениях в режиме "Движение" > "Время". При этом учитывается время движения (перемещения) ресничек, затем определяется частота движения в ед/с и проводится статистический анализ с определением среднего значения параметра. Среднее значение длины ресничек определяют в режиме "Подсчет и измерение". При необходимости измеряют длину и ширину эпителиальных клеток, размеры ядра, оценивают ядерно-цитоплазматическое соотношение.

Все параметры подлежат автоматической статистической обработке.

Оборудование для компьютеризированной морфометрии оснащено специальным поворотным устройством конденсора, который позволяет создавать эффект объемного изображения [69].

В РФ зарегистрирована "Программа определения частоты биения реснитчатого эпителия при первичной цилиарной дискинезии" (PCD High-Speed Video Microscopy Analysis (PCD HSVMA)), регистрационный номер программы N 2023687245.

Для повышения эффективности диагностики ПЦД на сегодняшний день существуют 3 принципиально разных метода цилиогенеза - метод суспензионной культуры, метод культуры клеток на границе раздела воздух-жидкость (Air-Liquid Interface cell culture - ALI) и метод культуры органоидов. Основу всех методов составляет дифференцировка клеток, выделенных при назальной биопсии, в реснитчатые клетки. Каждый метод цилиогенеза in vitro имеет свои преимущества и недостатки. Получение ALI-культуры является основным методом, при котором образуется больше реснитчатых клеток в сравнении с суспензионной культурой. Однако время цилиогенеза в ALI-культуре значительно больше, а продолжительность поддержания в культуре уступает методу органоидов. Метод ALI-культуры и метод органоидов позволяют проводить повторные анализы ультраструктуры ресничек (ТЭМ) и CBF, что помогает в диагностике ПЦД. Таким образом, клеточные модели реснитчатых клеток имеют хороший потенциал стать инструментом для получения диагностической и терапевтической информации о первичной цилиарной дискинезии и других заболеваниях, связанных с реснитчатыми клетками [70, 71, 72, 73].

- Рекомендовано пациентам с клиническими признаками ПЦД селективное (при возможности и необходимости) проведение трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) биоптата слизистой оболочки респираторного тракта в качестве дополнительного метода подтверждения диагноза и при сомнительных результатах проведенного обследования (световая микроскопия, высокоскоростной видеомикроскопический анализ) (Патолого-анатомического исследования биопсийного (операционного) материала тканей нижних дыхательных путей с применением электронно-микроскопических методов/Патолого-анатомическое исследование биопсийного (операционного) материала тканей верхних дыхательных путей с применением электронно-микроскопических методов) (с целью выявления ультраструктурных изменений аксонемы ресничек и/или жгутиков [74, 75, 76].

(УУР - C, УДД - 5)

Комментарий: метод ТЭМ доступен только в некоторых крупных научно-исследовательских лабораториях/институтах.

Метод ТЭМ для диагностики ПЦД имеет ряд ограничений: у 10 - 20% пациентов с диагнозом ПЦД, установленным с помощью других методов, в том числе, молекулярно-генетического обследования обнаруживается с нормальная ультраструктура аксонемы ресничек либо аномалия не диагностируемая (около 10 - 20% пациентов) [76, 77, 78, 79]. Эти случаи были обнаружены с помощью альтернативных диагностических тестов, включая высокоскоростной видеомикроскопический анализ, выявление низкого уровня оксида азота, аномальный профиль цилиарных белков при иммунофлуоресцентном окрашивании и/или патогенные варианты генов, связанных с ПЦД. Таким образом, ультраструктурное выявление аномалий аксонемы ресничек и жгутиков является достаточным, но не необходимым компонентом диагностики ПЦД. Метод входит во все протоколы диагностики ПЦД (Приложение Б1 "Алгоритмы диагностики ПЦД").

Следует учитывать вероятность вторичных и неспецифических изменений аксонемы реснитчатых клеток дыхательных путей за счет воспалительных и/или инфекционных процессов, а также естественную изменчивость реснитчатых клеток и гетерогенность их морфологии. В связи с этим существенное значение имеет электронно-микроскопическое исследование достаточного количества ресничек в каждом конкретном образце. В случае исследования респираторного эпителия необходимо выявление изменений ультраструктуры не менее 50 ресничек нескольких реснитчатых клеток.

Метод ALI-культуры и метод органоидов позволяют проводить анализ ультраструктуры ресничек (ТЭМ), в т.ч., повторно. Применение методов ALI-культуры или метода органоидов позволяют нивелировать ложноположительные результаты, вызванные повреждением ресничек вследствие воспаления [71].

При ультраструктурных исследованиях ресничек важным моментом является гомогенность (однотипность) выявленных нарушений в конкретном изучаемом образце. Однотипные нарушения должны быть выявлены либо тотально во всех изученных ресничках или жгутиках, либо в подавляющем большинстве.

Учитывая этот факт, метод обладает высокой специфичностью, но ограниченной чувствительностью. Наличие ультраструктурных дефектов достаточно для постановки диагноза и дополнительное обследование нецелесообразно. При отсутствии ультраструктурных дефектов, но при наличии четких клинических признаков, следует продолжить обследование [3].

Пример заключения по результатам ТЭМ в Приложении А3.5.

- Рекомендовано проведение эндоскопии носоглотки (Эндоскопическая эндоназальная ревизия полости носа, носоглотки) с забором биоптата (Биопсия слизистой оболочки полости носа/Биопсия слизистой оболочки носоглотки под контролем эндоскопического исследования) или трахеобронхоскопии с биопсией трахеи или бронха (Биопсия трахеи, бронхов при бронхоскопии) пациентам с клиническими признаками ПЦД с целью получения биоптата для проведения высокоскоростного видео-микроскопического анализа и/или ТЭМ и/или анализа частоты и паттерна биения ресничек в биоптате из полости носа или бронха с помощью световой микроскопии [69, 80, 81].

(УУР - C, УДД - 4)

Комментарий: