Приложение

к Решению Коллегии Евразийской

экономической комиссии

от 25 октября 2022 г. N 150

ИЗМЕНЕНИЯ,

ВНОСИМЫЕ В ФАРМАКОПЕЮ ЕВРАЗИЙСКОГО ЭКОНОМИЧЕСКОГО СОЮЗА

1. В абзаце четвертом общей фармакопейной статьи 2.1.2.25. слова "статья 2.2.2.36." заменить словами "статья 2.1.2.36.".

2. В общей фармакопейной статье 2.1.4.16. цифры "(600 +/- 5025) °C" заменить на "(600 +/- 25) °C".

3. В общей фармакопейной статье 2.1.6.6. слова "перечисленных в табл. 2.6.6.6.-1" заменить словами "перечисленных в табл. 2.1.6.6.-1".

4. В общей фармакопейной статье 2.1.9.3. рисунок 2.1.9.3.-2 заменить следующим рисунком:

Рисунок 2.1.9.3.-2. - Прибор 2, перемешивающий элемент - лопасть. Размеры в миллиметрах.

5. В нумерации раздела 2.2. "Реактивы, стандартные растворы, буферные растворы" цифры "2.2." заменить на "2.2.1.".

6. В общей фармакопейной статье 2.2.1.1. код "202010001-2019" заменить на "202010001-2022".

7. В общей фармакопейной статье 2.2.1.2. код "202010002-2019" заменить на "202010002-2022".

8. Общую фармакопейную статью 2.3.1.2. с кодом "203010002-2019" заменить на общую фармакопейную статью 2.3.1.2. с кодом "203010002-2022", указанную в пункте 10 настоящих изменений.

9. В общей фармакопейной статье 2.3.5.0. в рисунке 2.3.5.0.-1 слова "Субстанции для фармацевтического применения (2034)" заменить цифрами "2.3.18.0.".

10. Дополнить общими фармакопейными статьями следующего содержания:

2. ОБЩИЕ ФАРМАКОПЕЙНЫЕ СТАТЬИ

2.1. МЕТОДЫ АНАЛИЗА

2.1.2. ФИЗИЧЕСКИЕ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА

201020044-2022

2.1.2.44. Температура каплепадения

Температура каплепадения представляет собой температуру, при которой в условиях, приведенных ниже, первая капля расплавленного испытуемого образца падает из чашки.

Определение температуры каплепадения проводят для образцов, не растирающихся в порошок и плавящихся ниже температуры кипения воды, таких, как жиры, воск, парафин, вазелин, смолы.

При отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье и (или) нормативном документе по качеству применяют метод 1. Замена метода 1 на метод 2 должна быть подтверждена данными по валидации.

МЕТОД 1

Прибор. Для проведения испытания используют прибор, представленный на рисунке 2.1.2.44.-1. Прибор состоит из двух металлических гильз (А и Б), соединенных одна с другой посредством резьбы. Гильза А прикреплена к ртутному термометру. В нижней части гильзы Б с помощью двух уплотнителей Д свободно закреплена металлическая чашка Е. Точное положение чашки определяется фиксаторами Г длиной 2 мм, используемыми также для центровки термометра. Отверстие В в стенке гильзы Б предназначено для выравнивания давления. Отводящая поверхность чашки должна быть плоской, а края выходного отверстия - под прямым углом к поверхности. Нижняя часть ртутного термометра имеет форму и размер, как показано на рисунке 2.1.2.44.-1; пределы измерения термометра от 0 °C до 110 °C, расстояние на шкале в 1 мм соответствует разности температур в 1 °C. Шарик термометра имеет диаметр (3,5 +/- 0,2) мм и высоту (6,0 +/- 0,3) мм.

Рисунок 2.1.2.44.-1. - Прибор для определения температуры каплепадения. Размеры в миллиметрах. А - верхняя металлическая гильза; Б - нижняя металлическая гильза; В - отверстие для уравновешивания давления; Г - фиксаторы; Д - уплотнители; Е - металлическая чашка

Прибор устанавливают по оси пробирки длиной около 200 мм и наружным диаметром около 40 мм.

Прибор прикрепляют к пробирке с помощью пробки, в которую вставлен термометр и которая имеет боковую прорезь. Отверстие чашки должно находиться на расстоянии около 15 мм от дна пробирки. Все устройство погружают в стакан вместимостью около 1 л, заполненный водой. Дно пробирки должно находиться на расстоянии около 25 мм от дна стакана. Уровень воды должен достигать верхней части гильзы А. Для равномерного распределения температуры в стакане используют мешалку.

Методика. Испытуемый образец подготавливают в соответствии с указаниями частной фармакопейной статьи и (или) нормативного документа по качеству. Заполняют чашку до краев испытуемым образцом. Избыток образца удаляют с обеих сторон шпателем. После того, как гильзы А и Б соединены, проталкивают чашку внутрь на ее место в гильзе Б до упора. Удаляют шпателем образец, выдавленный термометром. Прибор помещают в водяную баню, как описано выше. Водяную баню нагревают до температуры примерно на 10 °C ниже предполагаемой температуры каплепадения и устанавливают скорость нагрева около 1 °C/мин. Отмечают температуру падения первой капли. Проводят не менее трех определений, каждый раз с новым образцом. Разность между показаниями не должна превышать 3 °C. За температуру каплепадения принимают среднее значение трех измерений.

МЕТОД 2 - АВТОМАТИЧЕСКИЙ МЕТОД

Прибор. Для проведения испытания используют прибор, представленный на рисунке 2.1.2.44.-2, который состоит из сборного картриджа, включающего держатель, в котором свободно фиксируется чашка с испытуемым образцом, и приемника с горизонтальным просветом, который фиксируется под чашкой. Данный картридж вставляют в блок нагревания. Блок представляет собой металлический цилиндр с цилиндрической щелью вдоль его вертикальной оси, внутри которой помещают сборный картридж. Кроме того, имеется другая, более узкая цилиндрическая вертикальная щель, в которую устанавливают температурный датчик на уровне чашки для проб. Снаружи нагревательного блока располагается электрический нагревательный элемент. Под нагревательный блок устанавливают лампу таким образом, чтобы поток света проходил через просвет в приемник на установленный напротив фотодатчик. Блок нагревания с помощью нагревательного элемента способен поддерживать точно установленную температуру, а также нагреваться медленно с постоянной определенной скоростью после начального изотермического периода.

Рисунок 2.1.2.44.-2. - Пример прибора автоматического определения температуры каплепадения. А - держатель чашки; Б - блок нагревания; В - источник света; Г - щель; Д - сборный картридж; Е - нагревательный элемент; Ж - чашка с испытуемым образцом; 3 - фотодатчик; И - приемник; К - температурный датчик

Методика. Испытуемый образец подготавливают согласно указаниям частной фармакопейной статьи и (или) нормативного документа по качеству и проводят испытание как указано ниже или в соответствии с инструкциями производителя. Избыток образца удаляют с обеих сторон чашки шпателем. Чашку помещают в держатель и присоединяют рукав. Сборный картридж помещают в блок нагревания. На приборе выставляют первоначальные изотермические условия и скорость постепенного нагревания в соответствии с указаниями частной фармакопейной статьи и (или) нормативного документа по качеству. Включают программу температурного режима. Когда первая капля расплавленного образца упадет через щель на дно чашки, тем самым прерывая поток света, сигнал фотодатчика приведет к автоматической регистрации температуры блока нагревания.

Калибровка прибора. Прибор используют в соответствии с инструкциями производителя. В зависимости от использования прибора и испытуемых образцов, регулярно проводят предписанную калибровку и проверку эксплуатационных характеристик системы. Обычно используют сертифицированные стандартные образцы бензойной кислоты и бензофенона. Допускается применение других веществ при условии, что они не проявляют полиморфизм. Калибровку проводят в соответствии с инструкциями производителя или следующим образом. Для каждого из двух сертифицированных стандартных образцов готовят по три чашки и размещают их на чистой поверхности. В каждую чашку помещают небольшое количество сертифицированного стандартного образца и уплотняют стержнем (диаметр около 4,5 мм). Проверяют, чтобы отверстие было полностью заполнено. Наполняют чашку примерно наполовину и уплотняют образцы с помощью стержня (диаметр около 9 мм). Чашку наполняют и уплотняют, при необходимости добавляя образец, пока чашка не будет полностью заполнена.

Температурная программа для бензойной кислоты: начальная температура - 118,0 °C; скорость нагрева - 0,2 °C/мин; конечная температура - 126,0 °C. После установки чашки выдерживают в течение 30 с при температуре 118 °C до начала нагревания.

Температурная программа для бензофенона: начальная температура - 44,0 °C; скорость нагрева - 0,2 °C/мин; конечная температура - 56,0 °C. После установки чашки выдерживают в течение 30 с при температуре 44 °C до начала нагревания.

Проверяют три отдельных результата. Результаты испытания считают достоверными, если полученные значения находятся в пределах +/- 0,3 °C от среднего значения.

Исправленное среднее значение температуры (T₂) рассчитывают по формуле:

T₁ - F,

где: T₁ - средняя температура каплепадения по трем измерениям, в градусах Цельсия;

F - поправка на разницу температур образца и места измерения температуры в нагревательном блоке (ее значение изменяется в зависимости от конструкции прибора автоматического определения температуры каплепадения и представляется производителем).

Принимая в расчет температуру каплепадения (T₀) сертифицированного стандартного образца, точность температурной шкалы считается удовлетворительной, если |T₂ - T₀| не превышает 0,3 °C.

201020045-2022

2.1.2.45. Спектрометрия ядерного магнитного резонанса

Спектрометрия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) - аналитический метод, позволяющий исследовать химическую структуру органических молекул по интерпретации их спектров ЯМР по магнитным моментам изотопов ¹H, ¹³C, ¹⁹F, ¹⁵N, ³¹P. Спектры ЯМР могут быть использованы для качественных и количественных анализов.

В соответствующих экспериментальных условиях интегрированная интенсивность сигналов ЯМР прямо пропорциональна числу спинов ядер молекулярной группы, ответственной за сигнал. Эти интегралы могут использоваться для количественного анализа.

ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ

При помещении группировки ядер с угловым моментом и магнитным моментом в статическое магнитное поле (B₀) ядра занимают по отношению к оси магнитного поля определенные ориентации, разрешенные в квантовой механике. Эти уровни энергетически различны. Колебательное высокочастотное магнитное поле (B₁), перпендикулярное магнитному полю B₀, вызывает переходы между этими уровнями с полным поглощением энергии. Согласно условию резонанса , (где - гиромагнитное отношение, - ларморова частота), магнитное поле B₀ или частота поля B₁ могут изменяться для получения спектра (метод непрерывной волны (МНВ)). В настоящее время излучение B₁ получают при помощи радиочастотного импульса (метод Фурье преобразования). Когерентное излучение, испускаемое при возвращении в исходное состояние, регистрируют в виде затухающей кривой, называемой спадом свободной индукции (ССИ). Последующее Фурье-преобразование дает спектр в области частоты, предоставляя информацию о молекулярной структуре. Дополнительные радиочастотные области применяются во время регистрации сигнала ССИ подавления скалярных взаимодействий (прямая связь) между ядрами (так называемое "распаривание"). Для качественного и количественного анализа жидких или твердых образцов можно применить одно- и многомерные методы.

Важную информацию о структуре вещества получают из следующих спектроскопических параметров, приведенных в таблице 2.1.2.45.-1.

Таблица 2.1.2.45.-1.

Корреляции различных спектральных параметров (например, химический сдвиг и константа спин-спинового взаимодействия, или химические сдвиги различных ядер в пределах одной молекулярной системы) могут быть получены гомо- и гетероядерными двумерными и более многомерными методами. Информацию о времени релаксации T₁ и T₂, о ядерных эффектах Оверхаузера и кинетике процессов, зависящих от времени, также можно получить с помощью соответствующих экспериментов.

ПРИБОР

ЯМР-спектрометр с высокой разрешающей способностью состоит из следующих частей:

- магнит для создания постоянного магнитного поля;

- термостатируемый датчик с держателем образца, предназначенный для подачи высокочастотного импульса и определения излучения, испускаемого образцом;

- электронное устройство для создания мощных высокочастотных импульсов, регистрации и преобразования сигнала ССИ в цифровую форму; это устройство также поддерживает стабильность электроники прибора;

- устройства сбора и обработки данных (компьютер);

также включает:

- проточную кювету для проведения жидкостной хроматографии ЯМР или проточно-инъекционного анализа;

- систему для создания импульсного градиента магнитного поля ЯМР.

Сильное магнитное поле генерируется катушкой сверхпроводимости в сосуде Дьюара, заполненного жидким гелием. Датчик, как правило, содержит образец в пробирке с внешним диаметром 5 мм или в проточной кювете, и соединен радиочастотными кабелями с электронным блоком, настроенным на частоту ¹H-ядер и изотопов X-ядер. Необходимыми являются дополнительные устройства для настройки и регулировки электронных контуров; кроме того, часто используют термостатирование образцов.

Следует подтвердить надлежащее функционирование ЯМР-спектрометра. Для этого используют соответствующие испытания, включающие, как правило, измерение ширины спектральной линии на полувысоте определенных пиков при определенных условиях, отношение сигнал/шум (S/N) для стандартных смесей, интенсивность импульса (измеренная как 90° ширины импульса), и воспроизводимость импульса. Все изготовители приборов предоставляют спецификации и протоколы измерения указанных параметров для определенных комбинаций прибор/датчик, и необходимо проводить проверку соответствия этим спецификациям.

ЯМР С ФУРЬЕ-ПРЕОБРАЗОВАНИЕМ (ЯМР-ФП)

Как правило, в современных спектрометрах используется принцип Фурье-преобразования: после возбуждения образца высокочастотным импульсом соответствующей частоты (v), амплитуды (B₁) и продолжительности и последующей короткой паузы (f_d) (время восстановления чувствительности приемника), усиленный аналоговый сигнал ССИ регистрируют в течение определенного времени (t_ac) и переводят в цифровую форму аналогово-цифровым преобразователем (АЦП), результаты сохраняют в памяти спектрометра. Выходной сигнал усиливается перед оцифровкой для максимального повышения чувствительности, не перегружая АЦП. При наблюдении за X-ядрами стандартный эксперимент включает, при необходимости, широкополосное ¹H распаривание (возбуждение) всех протонов. Для увеличения отношения сигнал/шум, многократные сигналы ССИ могут быть когерентно накоплены и суммированы. При Фурье-преобразовании данных этого временного интервала получают спектр области частот.

ПАРАМЕТРЫ

Следующие параметры влияют на результат эксперимента Фурье-преобразования, и должны контролироваться.

Ширина импульса . Импульс возбуждения направлен вдоль оси x так называемой рамки вращения, его продолжительность (или "ширина") определяет угол переворота и, таким образом, интенсивность резонансного сигнала:

, (1)

где: - продолжительность ("ширина") импульса;

- угол поворота рамки вращения;

- гиромагнитное отношение.

, (2)

где: M - наблюдаемая намагниченность;

M_о - общая намагниченность;

- угол поворота рамки вращения.

Наблюдаемая намагниченность максимальна при . Продолжительность импульса должна быть короткой, чтобы гарантировать, что все сигналы возбуждения в спектральной ширине имеют одинаковую интенсивность. Намагниченность затухает вследствие процессов релаксации.

Длительность паузы (t_d). Пауза - время между окончанием подачи импульса и началом сбора данных, необходимое по техническим причинам, поскольку ее длительность может влиять на интенсивность сигнала и фазу пика. Быстро затухающие сигналы (дающие начало широким спектральным линиям) уменьшаются в интенсивности больше, чем медленно затухающие сигналы (которые дают начало узким спектральным линиям).

Время сбора данных (t_ac). Время сбора данных связано со спектральной шириной (то есть всей наблюдаемой областью) и количеством точек цифрового разрешения, собранных во время обнаружения сигнала.

, (3)

где: SW - спектральная ширина;

DP - количество точек цифрового разрешения.

Максимальная интенсивность сигнала и отношение сигнала к шуму будут достигнуты, если время сбора данных приблизительно равняется , где v_1/2 - полная ширина на полувысоте, но для минимизации искажения сигнала эта величина должна быть более .

Время повторения (t_r). Спин-решеточная релаксация влияет на время, требуемое для спиновой системы, чтобы прийти в равновесие после импульса. Релаксация может быть уменьшена при помощи специальных реактивов. В количественном анализе используемое время повторения должно устанавливаться относительно спин-решеточной релаксации и угла поворота рамки вращения, во избежание эффектов насыщения.

Усиление приемника. Аналоговый сигнал, детектируемый датчиком, усиливают до оцифровки и хранения. Усиление сигнала должно быть отрегулировано либо автоматически, либо вручную, чтобы сигнал не перегружал АЦП, что может вызывать в свою очередь искажение сигнала, и позволит оцифровывать случайный шум, произведенный при исследовании (то есть быть отличным от нуля).

ОПТИМИЗАЦИЯ ПАРАМЕТРОВ СБОРА И ОБРАБОТКИ ДАННЫХ ПРИ КОЛИЧЕСТВЕННОМ АНАЛИЗЕ

Помимо параметров сбора данных, интенсивность сигнала зависит еще от нескольких параметров. После сбора достаточного количества циклов сканирования, сводный сигнал ССИ преобразовывается с помощью Фурье-преобразования. Для достоверного количественного определения должны быть оптимизированы следующие параметры.

Цифровое разрешение. Цифровое разрешение - частотное разделение между измеренными точками. Обработанный сигнал должен иметь не менее 5 измеренных точек выше полувысоты интегрируемых сигналов. Для улучшения цифрового разрешения перед преобразованием к концу экспериментальной ССИ могут быть прибавлены дополнительные точки нулевой интенсивности ("нулевое заполнение").

Отношение сигнал/шум. Это отношение между интенсивностью (высотой пика) определенного сигнала в ЯМР-спектре и случайных колебаний, которые обычно измеряются в области спектра, который не содержит сигналов от анализируемого вещества. Низкое значение отношения сигнал/шум ограничивает точность интегрирования пика и количественных определений. При отношении сигнал/шум равным или более 150:1 стандартное относительное отклонение при интегрировании пика может быть менее 1%. В программном обеспечении современных спектрометров имеются алгоритмы по определению отношения сигнал/шум соответствующих пиков. При анализе разбавленных растворов получить достаточно высокое отношение сигнал/шум довольно трудно, особенно при детектировании ядер, отличных от ¹H. Способы увеличения отношения сигнал/шум включают в себя:

- увеличение количества суммируемых измерений (n), поскольку отношение сигнал/шум увеличивается с увеличением ;

- использование экспоненциального умножения сигнала ССИ перед Фурье-преобразованием: экспоненциальный коэффициент умножения должен быть в зоне полной пиковой ширины на полувысоте;

- использование спектрометров с более высоким постоянным магнитным полем (B₀), так как отношение сигнал/шум пропорционально ;

- использование цифрового фильтра для уменьшения шума;

- использование датчиков, которые максимизируют фактор заполнения;

- использование криодатчиков, снижающих тепловые помехи.

Область интегрирования. Интенсивность ЯМР-сигналов получают интегрированием квази-аналогового сигнала или с помощью ступенчатого графика, или более точным интегрированием отдельных линий и цифровым представлением данных. При исследовании жидких образцов получают ЯМР-сигналы в виде линий лоренцевой формы. При отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье и (или) нормативном документе по качеству или когда происходит перекрывание пика, для испытуемого пика и пика сравнения должен использоваться одинаковый диапазон интегрирования, выраженный в виде кратного числа полной ширине на полувысоте пика.

Динамический диапазон. Динамический диапазон аналогово-цифрового преобразователя (АЦП) определяет минимальную линию интенсивности, которую можно наблюдать или количественно определить, при интегрировании двух сигналов с той же самой шириной спектральной линии. 16-битовый АЦП позволяет идентифицировать сигнал интенсивностью 0,003% относительно сильного сигнала, полностью заполняющего динамический диапазон АЦП.

ЯМР СПЕКТРОСКОПИЯ ОБРАЗЦОВ В РАСТВОРАХ

Большинство ЯМР исследований проводят на разбавленных растворах (приблизительно 1%) испытуемого образца в соответствующем растворителе, к которому может быть прибавлен в известной концентрации подходящий стандарт для калибровки химического сдвига.

Растворители. Растворитель должен растворять испытуемый образец без дальнейшего взаимодействия, если иное не указано в частной фармакопейной статье и (или) нормативном документе по качеству. Для минимизации интенсивных сигналов растворителей используют полностью дейтерированные растворители (дейтерия оксид P, дейтерированный хлороформ P, дейтерированный диметилсульфоксид P, дейтерированный ацетон P, дейтерированный метанол P и т.д.). Атомы растворителя дают сигналы, которые легко идентифицируются по их химическому сдвигу, и могут использоваться для калибровки оси химического сдвига (вторичный стандарт).

Сравнение. Спектральная характеристика, наиболее зависящая от химического окружения атома в молекуле, называется химическим сдвигом, обозначается буквой и измеряется в миллионных долях (ppm). Химический сдвиг резонансной частоты для ЯМР активного ядра X измеряется в миллионных долях (ppm), как разность между резонансной частотой этого ядра и резонансной частотой внутреннего стандарта сдвига, выраженная в герцах, деленная на основную рабочую частоту спектрометра, в мегагерцах, при данном постоянном магнитном поле:

, (4)

где: - химический сдвиг резонансной частоты для ЯМР активного ядра X, в ppm;

v_X,_{образец} - резонансная частота активного ядра X, в герцах;

v_X,_{сравнение} - резонансная частота внутреннего стандарта сдвига, в герцах;

v_прибор - основная рабочая частота спектрометра, в мегагерцах.

Условно принято, что точный химический сдвиг устанавливается по ¹H резонансной частоте тетраметилсилана P (ТМС), и обозначается как . Установив шкалу сдвигов ¹H относительно ТМС можно вычислить точную частоту любого другого X резонанса, и откалибровать масштаб его химического сдвига. Частоту (вторичного) стандартного образца при рассчитывают по ¹H частоте ТМС и табличному значению отношения частоты, определенной для изотопа, к частоте ¹H в ТМС:

, (5)

где: v_X,_{сравнение} - частота (вторичного) стандартного образца при ;

VH,_ТМС - ¹H частота тетраметилсилана;

SX,_{сравнение} - табличное значение отношения частоты, определенной для изотопа, к частоте ¹H в тетраметилсилане.

Стандартные образцы при и соответствующие значения приведены в таблице 2.1.2.45.-2.

Таблица 2.1.2.45.-2.

--------------------------------

<1> Химический сдвиг зависит от значения pH.

<2> DSS - натрия 2,2-диметил-2-силапентан-5-сульфонат.

На практике химические сдвиги X сравнивают, непосредственно используя соответствующий стандарт. В ¹H и ¹³C ЯМР главным образом используется внутренний стандарт, который при исследовании непосредственно прибавляют к испытуемому образцу. В ¹⁵N, ¹⁹F и ³¹P ЯМР часто используется внешний стандарт, когда образец и стандарт находятся в отдельных коаксиальных цилиндрических пробирках.

Стабилизация. Для предотвращения смещения спектра во времени выполняют процедуру стабилизации (дейтериевая стабилизация). Для этого, если иное не указано в частной фармакопейной статье и (или) нормативном документе по качеству, используют сигнал ²H (дейтерия), вызываемый дейтерированными растворителями.

КАЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ

Качественные ЯМР спектры используются как испытания на подлинность, при котором ¹H или ¹³C спектр испытуемого образца сравниваются со спектром стандартного образца или, реже, с опубликованным стандартным спектром. Спектры стандартных и испытуемых образцов должны быть получены с использованием тех же самых методик и условий проведения испытания. Пики в этих 2 спектрах или характеристичных областях спектров должны совпадать по положению, интенсивности и мульти-плетности. В соответствующих случаях может быть проведено математическое сопоставление, например, вычисление коэффициента корреляции. При отсутствии стандартного образца используют рабочий стандартный образец, идентичность которого была подтверждена альтернативными методами, или путем подтверждения того, что ЯМР спектр полностью совпадает с заявленной структурой материала.

КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ

Интенсивность сигнала в испытании ЯМР как правило представляет собой интегрированную площадь под кривой измеренного сигнала. Высота сигнала может быть мерой интенсивности только при одинаковом значении полной ширины на полувысоте и одинаковой мульти-плетности двух сигналов. В условиях практически полной релаксации между регистрируемыми сигналами интенсивность сигнала является истинной мерой количества ядер, ответственных за соответствующий сигнал:

I_A = K_S · N_A I_A = K_S · N_A, (6)

где: I_A - интенсивность сигнала;

N_A - количество ядер, ответственных за сигнал;

K_S - константа, включающая фундаментальные постоянные, свойства образца и параметры приемника; может не учитываться в случаях, когда интенсивности сигналов сопоставимы и можно получить прямую зависимость между количеством ядер в двух сравниваемых структурных группах A и B:

, (7)

где: N_i - количества ядер, принадлежащих различным структурным группам одной молекулы.

Количества ядер, принадлежащих различным структурным группам одной молекулы, представляют собой небольшие целые числа. Измеренные значения округляют до целых чисел. Однако правильное функционирование блока сбора и обработки данных легко проверяется путем сравнения точной интенсивности в пределах спектра любого подходящего органического соединения известной структуры.

Помимо того, что интенсивность сигналов, полученных от каждого компонента в смеси, связана друг с другом небольшими целыми числами, относительные молярные количества этих компонентов могут быть измерены сравнением нормализованных интенсивностей резонансов различных компонентов. Молярное отношение двух компонентов смеси вычисляют с помощью следующего уравнения:

. (8)

Результаты определения являются достоверными только в случаях, когда структуры молекул, для которых определены I_A и I_B, известны (или, по крайней мере, известны значения N для контролируемых групп). Определения проводят, используя метод внутреннего стандарта или метод нормализации пиков.

Метод внутреннего стандарта. Массу образца A можно определить, если к раствору в качестве стандарта интенсивности прибавляют известную массу вещества B с известным его процентным содержанием. Уравнение (8) может быть преобразовано в уравнение (9):

, (9)

где: M_i - молекулярные массы;

m_A - масса образца A;

m_B - известная масса образца B;

P_B - чистота образца B, выраженная в процентах.

Стандарт интенсивности должен быть тщательно выбран; он должен быть полностью растворим в растворителе, используемом для образца, должен производить лишь небольшое количество сигналов, и у "контролируемой группы" должен быть сигнал в пустой спектральной области. Для этих целей рекомендуется выбирать соединение с высокой чистотой и с относительно высокой молекулярной массой.

Метод внутренней нормализации. Относительное содержание компонентов в смеси, степень замещения в структурно-измененном полимере или количество примеси можно определить путем сравнения относительных интенсивностей полученных резонансов.

Методика должна быть валидирована в отношении отсутствия наложения соответствующих сигналов. Когда в образце присутствуют вещества с не четко установленной структурой или молекулярной массой (например, эмульгатор), прибавление известного количества этого материала в пробирку для ЯМР позволяет построить калибровочную кривую.

МЕТОД

Подготовка образца. Испытуемый образец растворяют в растворителе, к которому может быть прибавлен соответствующий стандартный образец для калибровки химического сдвига, как указано в частной фармакопейной статье. Для количественного анализа растворы не должны содержать нерастворенных частиц. При некоторых количественных определениях может потребоваться прибавление внутреннего стандарта для сравнения интегрированных резонансов испытуемого и стандартного образцов. Соответствующие стандартные образцы и их концентрации указаны в частных фармакопейных статьях. В других количественных определениях результат получают путем сравнения относительной интенсивности двух или всех резонансов, полученных при исследовании образца. После помещения образца в пробирку и укупорки, образец вводят в магнит ЯМР установки, устанавливают параметры испытания и проводят измерения. Основные параметры испытания приводятся в частных фармакопейных статьях.

Процедура измерения. Уравновешивают образец в датчике и регулируют прибор для получения наиболее оптимальных условий резонанса и максимального отношения сигнал/шум путем подбора настройки датчика для данного объема образца для обеспечения максимальной однородности магнитного поля во всем объеме испытуемого образца (процедура "шиммирования"). Параметры настройки записывают или сохраняют в компьютере. Условия испытания могут включать выполнение многократных последовательных циклов "импульс - сбор данных - пауза", и отдельные ССИ сигналы суммируются в памяти компьютера, с усреднением уровня шума. Когда соответствующий уровень отношения сигнал/шум достигнут, ССИ сохраняют и спектр области частот получают путем Фурье-преобразования суммированных ССИ сигналов.

ЯМР СПЕКТРОМЕТРИЯ ОБРАЗЦОВ В ТВЕРДОМ СОСТОЯНИИ

Анализ образцов в твердом состоянии может быть выполнен с помощью специально оборудованных ЯМР спектрометров. Определенные технические процедуры обеспечивают выделение отдельных линий для определенных положений атомов, а также позволяют использовать ЯМР для оценки неорганических материалов.

Одна из таких процедур - быстрое вращение (4 - 30 кГц) порошкообразного образца в роторе (внешний диаметр около 4 мм) находящегося под углом 54,7° ("магический угол") к оси магнитного поля B₀. Этот способ называется вращением под магическим углом. Второй эффективный способ - силовое распаривание, и третий способ - перенос поляризации от легковозбудимых ядер к менее поляризуемым ядрам, то есть кросс-поляризация. Комбинация таких процедур позволяет получить спектры с высоким разрешением, содержащие большое количество информации о химических и структурных характеристиках твердых стекловидных тел, веществ в аморфном состоянии, кристаллов керамической, полимерной или минеральной природы.

При использовании ЯМР спектрометрии для оценки образца в твердом состоянии, полное описание процедуры приводят в частной фармакопейной статье.

201020046-2022

2.1.2.46. Термический анализ

Данная общая фармакопейная статья распространяется на группу методов термического анализа (МТА), при помощи которых определяется зависимость различных физических свойств веществ от температуры. Обычно в большинстве используемых методов определяют изменение энергии или массы испытуемого образца.

Эти методы имеют различные применения:

- определение фазовых изменений;

- определение изменений в химическом составе;

- определение чистоты.

К МТА относят термогравиметрию (ТГ), термометрическое титрование (ТТ), дифференциальный термический анализ (ДТА), дифференциальную сканирующую калориметрию (ДСК), дериватографию (ДГ), термомикроскопию (ТМ).

МТА, как правило, не требуют больших количеств веществ, непродолжительны по времени испытания. В случае применения МТА, в частных фармакопейных статьях и (или) нормативных документах по качеству следует указывать параметры, необходимые для корректного выполнения методики, например: скорость и температуру нагревания, инертный газ и скорость его потока.

ТЕРМОГРАВИМЕТРИЯ

Термогравиметрия (ТГ) или термогравиметрический анализ (ТГА) представляет собой метод, при помощи которого регистрируют изменение массы испытуемого образца от программированного изменения температуры.

Прибор. Основными составляющими частями прибора являются: устройство для нагревания или охлаждения образца в соответствии с заданной температурной программой, камера для образца с контролируемой средой, электронные весы и устройства для регистрации.

Проверка температурной шкалы. Поверку температурного датчика, находящегося близко к образцу или контактирующего с ним, проводят, используя температуру фазового перехода второго рода (точка Кюри) ферромагнитного вещества (например, никеля). В случае прибора, позволяющего одновременно проводить ТГ/ТГА и ДТА или ДСК, могут быть использованы те же сертифицированные (аттестованные) стандартные образцы, что и для ДТА и ДСК, например, индий, олово и (или) цинк.

Калибровка электронных весов. Необходимое количество подходящего сертифицированного (аттестованного) стандартного вещества (например, СО ФЕАЭС кальция оксалата моногидрата) помещают в держатель и регистрируют его массу. Устанавливают скорость нагревания соответственно инструкции изготовителя (например, 5 °C/мин) и начинают повышение температуры. Термогравиметрическую кривую регистрируют в виде графика: величины температуры или времени указывают по оси абсцисс по возрастанию значений слева направо; показания массы - по оси ординат по возрастанию значений снизу вверх. При температуре около 250 °C повышение температуры останавливают. На графике измеряют расстояние между начальным и конечным плато масса-температура или плато масса-время, что соответствует изменению массы образца. Полученную величину потери в массе аттестованного стандартного вещества сопоставляют с величиной, указанной на маркировке.

Методика. Для испытуемого образца проводят ту же процедуру в условиях, указанных в частной фармакопейной статье и (или) нормативном документе по качеству. Потерю в массе испытуемого образца определяют, измеряя расстояние между начальным и конечным плато на гравиметрической кривой, и выражают в процентах .

При регулярном использовании прибора периодически проводят калибровку и проверку температурной шкалы. В противном случае эти операции проводят перед каждым использованием.

Так как условия проведения испытания являются критичными, для каждого измерения отмечают следующие параметры: давление или скорость потока; состав газа, масса образца, скорость нагревания, диапазон температуры и предварительная обработка образца, включая любой изотермический период.

ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ СКАНИРУЮЩАЯ КАЛОРИМЕТРИЯ

ДСК является методом, который используется для демонстрации энергетических явлений, происходящих при нагревании (или охлаждении) вещества (или смеси веществ) и для определения изменений в энтальпии и удельной теплоемкости, а также температур, при которых эти изменения происходят.

Данный метод используют для установления различий в количестве теплоты (относительно температуры), выделенной или поглощенной испытуемым образцом и с ячейкой сравнения в зависимости от температуры. Существует 2 типа приборов для ДСК: приборы, использующие компенсацию энергии для удерживания нулевой разницы температуры между испытуемым образцом и ячейкой сравнения; приборы, поддерживающие постоянную скорость нагревания и определяющие температурный дифференциал как разность в тепловом потоке между испытуемым образцом и ячейкой сравнения.

Прибор. Для ДСК с компенсацией энергии используют прибор, состоящий из печи, имеющей держатель образцов с испытуемой ячейкой и ячейкой сравнения. Прибор для ДСК с тепловым потоком состоит из печи, содержащей единственную ячейку с держателем образца для испытуемого тигля и тигля сравнения.

К прибору присоединяют: устройство для программирования температуры, температурный детектор (детекторы) и регистрирующую систему, подсоединенную к компьютеру. Измерения проводятся в контролируемой среде.

Калибровка прибора. Прибор калибруют на предмет изменения температуры и энтальпии с использованием сертифицированных (аттестованных) стандартных образцов.

Калибровка температуры. Калибровка температуры может быть проведена с использованием сертифицированных (аттестованных) стандартных образцов, имеющих характеристическое теплофизическое свойство, такое как температура плавления чистых металлов или органических веществ или температура фазового перехода кристаллических неорганических солей или оксидов. Обычно для калибровки используют значения температуры плавления индия, олова и (или) цинка.

Калибровка количества теплоты. Для точной оценки изменения количества теплоты (изменение энтальпии) испытуемого образца, вызванного определенным физическим изменением, происходящим при изменении температуры, необходимо проводить калибровку прибора с использованием подходящих сертифицированных (аттестованных) стандартных образцов. По аналогии с калибровкой температуры калибровка количества теплоты может быть выполнена с использованием сертифицированных (аттестованных) стандартных образцов с известными установленными значениями изменения энтальпии, вызванного физическими изменениями, такими как плавление чистых металлов и (или) органических веществ или фазовый переход кристаллических неорганических солей. Обычно для калибровки используют значения теплоты плавления индия, олова и (или) цинка.

Проведение испытания. В подходящий тигель взвешивают испытуемый образец в количестве, указанном в частной фармакопейной статье и (или) нормативном документе по качеству, и помещают в держатель образца. Пустой тигель помещают в держатель для тигля сравнения. Устанавливают температуру начала и конца испытания и скорость нагрева, указанные в частной фармакопейной статье и (или) нормативном документе по качеству.

Начинают испытание и регистрируют кривую ДСК с указанием величины температуры или времени по оси абсцисс (по возрастанию значений слева направо) и изменения энергии по оси ординат (уточняют, процесс эндотермический или экзотермический).

Температура, при которой происходит явление (начальная температура), соответствует точке пересечения (A) продолжения базовой линии и касательной к точке наибольшего наклона (точке перегиба) кривой (см. рисунок 2.1.2.46.-1). Конечная температура теплового явления соответствует пику на кривой.

Рисунок 2.1.2.46.-1. - Термограмма

Значение энтальпии пропорционально значению площади под кривой, ограниченной базовой линией; коэффициент пропорциональности находят путем измерения теплоты плавления известного вещества (например, индия) при тех же условиях проведения испытания.

Каждая термограмма сопровождается следующими данными: условия испытания, запись последней калибровки, масса испытуемого образца, идентификация (включая тепловые изменения) образца, емкость (контейнер), среда (состав, скорость потока, давление), направление и скорость температурных изменений, чувствительность прибора и регистрирующего устройства.

ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ

Фазовые изменения. Определение температуры, изменения теплоемкости и энтальпии при фазовых изменениях, происходящих с веществом в зависимости от температуры. В таблице 2.1.2.46.-1 приведены возможные наблюдаемые переходы.

Таблица 2.1.2.46.-1.

Изменения химического состава. Измеряя теплоту и температуру реакции при данных условиях, определяют, например, кинетику разложения или десольватацию.

Использование для построения диаграмм фазового равновесия. Построение диаграмм фазового равновесия для твердых смесей. Создание фазовой диаграммы может быть важным этапом при предварительной разработке и оптимизации процесса лиофилизации.

Определение чистоты. Измерение теплоты плавления и температуры плавления с помощью ДСК делает возможным определение содержания примесей в веществе по одной диаграмме, с использованием нескольких миллиграмм образца, и без необходимости проведения повторных точных измерений истинной температуры.

Теоретически, плавление полностью чистого кристаллического вещества при постоянном давлении характеризуется теплотой плавления в бесконечно узком диапазоне, соответствующем температуре плавления. Расширение этого диапазона является чувствительным индикатором присутствия примесей. Таким образом, при испытании образцов одного и того же вещества с содержанием примесей, отличающимся на несколько десятых процента, получают визуально отличающиеся друг от друга термические диаграммы (см. рисунок 2.1.2.46.-2).

Рисунок 2.1.2.46.-2. - Термограмма вещества в зависимости от чистоты

Определение молярной чистоты с помощью ДСК основано на использовании математического приближения интегральной формы уравнения Вант-Гоффа применительно к концентрациям (не к активностям) в бинарной системе . Для небольших содержаний примесей (x₂ << 1) и для значений температуры, близких к температуре плавления, уравнение может быть представлено, как приведено ниже, где температура образца и молярная доля примеси являются переменными:

, (1)

где: T - температура образца, в кельвинах

T₀ - температура плавления химически чистого вещества, в кельвинах;

R - газовая постоянная для идеальных газов, в джоуль · кельвин^-1 · моль^-1;

- молярная теплота плавления вещества, в джоуль · моль^-1

x₂ - молярная доля примеси, то есть число молекул примеси, разделенное на общее число молекул в жидкой фазе (или в расплавленной фазе) при температуре T (выраженной в кельвинах).

Таким образом, определение чистоты с помощью ДСК ограничено обнаружением примесей, образующих эвтектические смеси с основным веществом и присутствующих в испытуемом образце с молярной долей менее 2%.

Данный метод не применяют для:

- аморфных веществ;

- сольватов или полиморфных соединений, которые нестабильны в пределах, используемых при испытании температур;

- примесей, образующих твердые растворы с основным веществом;

- примесей, которые нерастворимы в жидкой фазе или в расплаве основного вещества.

Во время нагревания испытуемого образца примеси полностью плавятся при температуре эвтектической смеси. Выше этой температуры твердая фаза содержит только чистое вещество. Так как температура постепенно увеличивается от температуры эвтектической смеси до температуры плавления чистого вещества, молярная доля примеси в жидкой фазе постоянно падает по причине увеличения количества расплавленного чистого вещества. Для всех температур выше эвтектической точки:

, (2)

где: F - расплавленная доля анализируемого образца;

- молярная доля примеси в анализируемом образце.

Если образец расплавлен полностью, то F = 1 и .

При объединении уравнений (1) и (2) получается следующее выражение:

.

Значение теплоты плавления получают путем интегрирования пика плавления.

Температура плавления чистого вещества экстраполируется из графика зависимости 1/F от температуры, выраженной в кельвинах. Наклон графика, при необходимости полученного после линеаризации, соответствующий , позволяет определить значение молярной доли примеси в анализируемом образце.

Молярная доля примеси в анализируемом образце, умноженная на 100, дает молярную долю всех эвтектических примесей в процентах.

201020047-2022

2.1.2.47. Потенциометрическое определение концентрации ионов с использованием ионоселективных электродов

Теоретически электродный потенциал (E) ионоселективного электрода находится в линейной зависимости от логарифма активности данного иона, что выражается уравнением Нернста:

,

где: E₀ - стандартный электродный потенциал используемого электрода;

R - универсальная газовая постоянная;

T - абсолютная температура;

F - число Фарадея;

z_i - величина заряда иона с обозначением его знака;

a_i - активность иона.

При постоянной ионной силе выполняется уравнение:

,

где: C_i - молярная концентрация иона;

f - коэффициент активности (a_i = f · C_i);

.

Если: , где b - наклон калибровочной кривой электрода (наклон электродной функции), в таком случае выполняется уравнение:

E = E₀' + blgC_i,

и для -lgC_i = pC_i: E = E₀' - bpC_i.

Потенциометрическое определение концентрации ионов проводят путем измерения разницы потенциалов между двумя подходящими электродами, погруженными в испытуемый раствор; индикаторный электрод является селективным по отношению к определяемому иону, другой является электродом сравнения.

Прибор. Используют вольтметр, позволяющий выполнять измерения с точностью 0,1 мВ, с входным сопротивлением в 100 раз превышающим сопротивление используемых электродов.

В качестве ионоселективных электродов используют преимущественно электроды с кристаллической или некристаллической мембраной или с твердой основой (например, стеклянные электроды), или электроды с заряженными (положительно или отрицательно) или с незаряженными подвижными носителями, или сенсибилизированные электроды (ферментные электроды, газ-индикаторные электроды). Электродом сравнения обычно является хлорсеребряный электрод с подходящими соединяющими инертными жидкостями, исключающими их перемешивание.

Методика. Измерения проводят при постоянной температуре с точностью +/- 0,5 °C, учитывая изменение наклона электродной функции электрода в зависимости от температуры (см. таблицу 2.1.2.47.-1).

Таблица 2.1.2.47.-1. - Значения k при различных температурах

Ионную силу и, если необходимо, pH испытуемого раствора корректируют буферными растворами, указанными в частной фармакопейной статье и (или) нормативном документе по качеству; для уравновешивания электрод погружают в испытуемый раствор, который медленно перемешивают с постоянной скоростью, и регистрируют установившееся показание прибора.

Если электродная система используется часто, то регулярно проверяют воспроизводимость и стабильность сигнала, линейность калибровочной кривой или расчетного алгоритма в пределах концентраций испытуемого раствора, если нет, то проводят проверку перед каждой серией измерений.

Показания прибора считают линейными, если наклон калибровочной кривой приблизительно равен отношению:

.

МЕТОД 1 (МЕТОД КАЛИБРОВОЧНОЙ КРИВОЙ)

Последовательно измеряют не менее трех раз потенциалы не менее трех растворов сравнения в диапазоне ожидаемой концентрации испытуемого раствора. Рассчитывают уравнение калибровочной кривой или строят график зависимости среднего значения потенциала от соответствующего ему значения концентрации определяемого иона, выраженного как -lgC_i или pC_i.

Испытуемый раствор готовят в соответствии с указаниями частной фармакопейной статьи и (или) нормативного документа по качеству; три раза измеряют потенциал и рассчитывают концентрацию определяемого иона по среднему значению потенциала, используя калибровочную кривую.

МЕТОД 2 (МЕТОД МНОГОКРАТНЫХ СТАНДАРТНЫХ ДОБАВОК)

Испытуемый раствор готовят в соответствии с указаниями частной фармакопейной статьи и (или) нормативного документа по качеству. Измеряют при установившемся равновесии потенциал в объеме этого раствора с неизвестной концентрацией определяемого иона. К известному объему испытуемого раствора не менее трех раз последовательно прибавляют объем раствора сравнения, незначительный в сравнении с объемом испытуемого раствора (не более 0,01 от объема испытуемого раствора), с известной концентрацией, значения которой находятся в пределах линейной части калибровочной кривой. После каждого прибавления измеряют потенциал и рассчитывают разность потенциалов между измеряемым потенциалом и потенциалом при установившемся равновесии. Величина разности потенциалов связана с концентрацией определяемого иона уравнением:

или

,

где: V_T - объем испытуемого раствора;

C_T - концентрация определяемого иона в испытуемом растворе;

V_S - объем прибавляемого раствора сравнения;

C_S - концентрация определяемого иона в растворе сравнения;

b - наклон электродной функции, установленный экспериментально при постоянной температуре путем измерения разности потенциалов, полученной при измерении двух растворов сравнения, концентрации которых отличаются в 10 раз и находятся в пределах линейной части калибровочной кривой.

Строят график зависимости (ось ординат) от объема прибавляемого раствора сравнения (ось абсцисс) и экстраполируют полученную линию до пересечения с осью абсцисс. В точке пересечения концентрацию определяемого иона в испытуемом растворе рассчитывают по формуле:

.

МЕТОД 3 (МЕТОД ОДНОКРАТНОЙ СТАНДАРТНОЙ ДОБАВКИ)

К известному объему испытуемого раствора, приготовленного в соответствии с указаниями частной фармакопейной статьи и (или) нормативного документа по качеству, прибавляют объем раствора сравнения известной концентрации определяемого иона, находящейся в линейной части калибровочной кривой. Параллельно в тех же условиях готовят контрольный раствор. Потенциалы испытуемого раствора и контрольного раствора измеряют не менее трех раз до прибавления и после прибавления раствора сравнения. Рассчитывают концентрацию определяемого иона, используя уравнение и учитывая контрольный раствор:

,

где: V_T - объем испытуемого раствора или контрольного раствора;

C_T - концентрация определяемого иона в испытуемом растворе;

V_S - объем прибавляемого раствора сравнения;

C_S - концентрация определяемого иона в растворе сравнения;

- среднее значение разницы потенциалов, измеренных до и после прибавления объема V_S;

b - наклон электродной функции, установленный экспериментально при постоянной температуре путем измерения разности потенциалов, полученный из двух растворов сравнения, концентрации которых отличаются в 10 раз и находятся в пределах линейной части калибровочной кривой.

201020048-2022

2.1.2.48. Рентгенофлуоресцентная спектрометрия

Метод рентгенофлуоресцентной спектрометрии основан на измерении рентгеновского излучения, испускаемого атомами при их облучении внешним источником излучения, и используется для определения содержания химических элементов с атомными номерами от 4 до 92.

Измерение рентгеновского излучения проводят с помощью волнодисперсионных или энергодисперсионных рентгенофлуоресцентных спектрометров, различающихся способом детектирования.

В волнодисперсионных рентгенофлуоресцентных спектрометрах рентгеновское излучение, испускаемое образцом, направляется на кристалл, где происходит его преломление на угол, зависящий от энергии излучения. Интенсивность преломленного рентгеновского излучения последовательно измеряется детектором.

В энергодисперсионных рентгенофлуоресцентных спектрометрах рентгеновское излучение образца направляется на твердотельный детектор, генерирующий электрические импульсы с амплитудой, пропорциональной энергии каждого детектируемого фотона рентгеновского излучения. Спектрометры такого типа позволяют получить спектр исследуемого образца, содержащий полную информацию о его составе.

Интенсивность флуоресценции элемента зависит от его концентрации в образце, а также от поглощения матрицей возбуждающего и испускаемого излучения. Если концентрация следовых количеств определяемого элемента входит в область линейности калибровочного графика, интенсивность измеренной при определенной длине волны флуоресценции элемента, находящегося в матрице определенного состава, прямо пропорциональна концентрации данного элемента и обратно пропорциональна массовому коэффициенту ослабления (поглощения) матрицы при этой длине волны, который может быть обусловлен присутствием и концентрацией других элементов в образце, составом матрицы образца и размером частиц материала.

Методика. Настройку и использование прибора проводят в соответствии с инструкциями производителя. Жидкие образцы измеряют непосредственно; твердые образцы могут быть измерены непосредственно, после предварительного прессования в таблетки (гранулы), иногда после смешивания с подходящим связывающим материалом либо сплавления. Необходимо, чтобы образец имел достаточную толщину для того, чтобы возможные небольшие отклонения в толщине не влияли на измеряемое рентгеновское излучение. Для повышения чувствительности при количественном определении легких элементов измерения могут проводиться в вакууме, в среде азота или гелия. Для калибровки прибора, проверки пригодности системы и контроля работоспособности используют подходящие сертифицированные стандартные образцы, при этом при анализе лекарственных средств предпочтительно использовать стандартные образцы с высоким содержанием углерода.

Проверка пригодности системы. Перед проведением испытания для подтверждения правильности работы системы проверяют ее пригодность. Проверка считается пройденной, если полученные результаты не отличаются от действительного значения более чем на 5% в случае количественного определения содержания компонентов лекарственных средств или вспомогательных веществ, и более чем на 20% в случае количественного определения содержания примесей элемента. Сравнение с результатами, полученными альтернативным методом, например, с помощью атомно-абсорбционной спектрометрии, также может быть использовано для проверки пригодности системы, при этом в случае количественного определения критерий приемлемости может быть принят равным 10%.

Контроль работоспособности прибора. Для обеспечения достоверности результатов измерений необходимо гарантировать стабильную работу прибора в течение продолжительного периода времени. Выбор процедур, критериев приемлемости и временных интервалов для этого должен отталкиваться от типа используемого оборудования и его предполагаемого использования. Например, контроль можно осуществлять путем оценки x-оси (угол или энергия) и y-оси (интенсивность), а также разрешающей способности детектора (с требованиями, что значения разрешающей способности не должны отклоняться от значения, определенного при калибровке оборудования, более чем на 20% для количественного определения компонентов и более чем на 25% для подлинности и количественного определения примесей элементов).

Валидационные требования. В случае методик определения примесей руководствуются требованиями к валидации, представленными в общей фармакопейной статье 2.1.4.23. Определение примесей элементов. В остальных случаях пользуются общей фармакопейной статьей 2.3.14.0. Валидация аналитических методик.

Если при проведении испытания требуется проведение пробоподготовки, то введение добавок в испытуемый образец осуществляют до начала ее первой стадии.

201020049-2022

2.1.2.49. Молекулярно-массовое распределение декстранов

Определение проводят методом эксклюзионной хроматографии (2.1.2.29).

Испытуемый раствор. 0,200 г испытуемого образца растворяют в подвижной фазе и доводят тем же растворителем до объема 10 мл.

Маркерный раствор. 5 мг глюкозы P и 2 мг СО ФЕАЭС декстрана V₀ растворяют в 1 мл подвижной фазы.

Калибровочные растворы. Навеску каждого из указанных стандартных образцов: 15 мг СО ФЕАЭС декстрана 4 для калибровки, 15 мг СО ФЕАЭС декстрана 10 для калибровки, 20 мг СО ФЕАЭС декстрана 40 для калибровки, 20 мг СО ФЕАЭС декстрана 70 для калибровки и 20 мг СО ФЕАЭС декстрана 250 для калибровки по отдельности растворяют в 1 мл подвижной фазы.

Раствор для проверки пригодности хроматографической системы. 20 мг СО ФЕАЭС декстрана 40 для проверки пригодности хроматографической системы (для анализа субстанции декстрана 40) или 20 мг СО ФЕАЭС декстрана 60/70 для проверки пригодности хроматографической системы (для анализа субстанций декстрана 60 и декстрана 70) растворяют в 1 мл подвижной фазы.

При отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье допускается использовать следующие условия хроматографирования:

- колонка длиной 0,3 м и внутренним диаметром 10 мм, заполненная агарозой поперечно-сшитой для хроматографии P, или серия колонок длиной 0,3 м и внутренним диаметром 10 мм каждая, заполненных полиэфирным гидроксилированным гелем для хроматографии P;

- подвижная фаза: раствор 7 г натрия сульфата безводного P и 1 г хлорбутанола P в 1 л воды P;

- скорость подвижной фазы: от 0,5 мл/мин до 1 мл/мин, поддерживаемая постоянно с точностью +/- 1% в час;

- детектор: дифференциальный рефрактометрический;

- петлевой дозатор: объем от 100 мкл до 200 мкл;

- температура системы: поддерживают постоянной с точностью +/- 0,1 °C.

КАЛИБРОВКА ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ

Хроматографируют несколько раз выбранный объем маркерного раствора. На хроматограмме должны присутствовать 2 пика: первый пик соответствует СО ФЕАЭС декстрана V₀, второй пик - глюкозе P. Исходя из объема элюирования декстрана V₀, рассчитывают объем эксклюзии V₀; полный объем V_t рассчитывают по пику, соответствующему глюкозе.

Хроматографируют определенный объем каждого из калибровочных растворов. Для каждой полученной хроматограммы проводят базовую линию. Каждую хроматограмму делят вертикальными равноудаленными линиями на p секций (количеством не менее 60), что соответствует равным объемам элюирования. Для каждой секции i, соответствующей объему элюирования V_i, измеряют высоту (y_i) от базовой линии до линии хроматограммы и рассчитывают коэффициент распределения (K_i) по формуле:

, (1)

где: V₀ - объем эксклюзии, определенный по пику, соответствующему СО ФЕАЭС декстрана V₀ на хроматограмме маркерного раствора;

V_t - полный объем колонки, определенный по пику, соответствующему глюкозе на хроматограмме маркерного раствора;

V_i - объем элюирования для секции i, полученный для хроматограммы каждого из калибровочный растворов.

Калибровку проводят, используя один из следующих методов.

Калибровка путем построения калибровочного графика. По уравнению (1) для каждого из декстранов для калибровки рассчитывают коэффициент распределения K_max, соответствующий максимальной высоте линии хроматограммы. На полулогарифмической бумаге строят зависимость значений K_max (ось абсцисс) от молекулярной массы для максимальной высоты линии хроматограммы (M_max) каждого из декстранов для калибровки и глюкозы (ось ординат). Через все полученные точки проводят первую калибровочную линию, экстраполируя ее из точки K_max, полученной для СО ФЕАЭС декстрана 250 для калибровки, до более низких значений K, полученных для тех же стандартных растворов (см. рисунок 2.1.2.49.-1).

Рисунок 2.1.2.49.-1. - Пример калибровочного графика. Пунктиром обозначена часть калибровочного графика, полученная экстраполированием. Горизонтальными линиями в нижней части рисунка указаны ширина и положения хроматографических линий, полученных для каждого декстрана для калибровки

Используя полученный первый калибровочный график, находят для всех значений K_i для всех хроматограмм соответствующие значения молекулярных масс M_i, получая таким образом графическую зависимость для расчета молекулярно-массового распределения. Для каждого декстрана для калибровки рассчитывают среднюю молекулярную массу по уравнению (3), приведенному ниже. Калибровочный график может быть использован для расчетов, если рассчитанные значения для каждого из декстранов для калибровки не отличаются от указанных в сопроводительной документации значений больше чем на 5% и среднее отклонение для всех декстранов не превышает +/- 3%. Если данные условия не выполняются, калибровочный график смещают вдоль оси ординат и повторяют вышеописанные операции, пока рассчитанные и указанные в сопроводительной документации значения будут отличаться не более чем на 5%.

Калибровка при помощи расчетного метода. При помощи уравнений (2) и (3), приведенных ниже, и подходящего метода (возможно использование итеративного метода, такого как модифицированного Хартли метода Гаусса-Ньютона; также возможно построение кривой при помощи компьютерных программ, которые используют принцип нелинейного регрессионного анализа) рассчитывают значения коэффициентов b₁, b₂, b₃, b₄ и b₅, которые должны составлять для глюкозы 180 +/- 2, а для декстранов для калибровки могут отличаться не более чем на 5% от соответствующих значений, указанных в сопроводительной документации.

, (2)

, (3)

где: p - число секций, на которые поделена хроматограмма;

y_i - высота хроматографической линии над базовой линией в i-той секции;

M_i - молекулярная масса для секции i.

ПРИГОДНОСТЬ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ

Хроматографируют подходящий объем соответствующего раствора для проверки пригодности хроматографической системы.

Средняя молекулярная масса СО ФЕАЭС декстрана для проверки пригодности хроматографической системы. Рассчитывают значение , как указано в разделе "Калибровка хроматографической системы", используя калибровочный график или значения коэффициентов b₁, b₂, b₃, b₄ и b₅. Результаты анализа считаются достоверными, если полученное значение находится в пределах:

- от 41 000 до 47 000 (для СО ФЕАЭС декстрана 40 для проверки пригодности хроматографической системы);

- от 67 000 до 75 000 (для СО ФЕАЭС декстрана 60/70 для проверки пригодности хроматографической системы).

Средняя молекулярная масса 10% высокомолекулярной фракции декстрана. Значение для 10% высокомолекулярной фракции декстрана, которая элюируется в секциях от 1 до n включительно, рассчитывают по формуле:

, (4)

где n определяется неравенствами:

, (5)

, (6)

где: p - количество секций, на которые разделена хроматограмма;

y_i - высота хроматографической линии над базовой линией для секции i;

M_i - молекулярная масса для секции i.

Результаты анализа считаются достоверными, если полученное значение для 10% высокомолекулярной фракции декстрана находится в пределах:

- от 110 000 до 130 000 (для СО ФЕАЭС декстрана 40 для проверки пригодности хроматографической системы);

- от 190 000 до 230 000 (для СО ФЕАЭС декстрана 60/70 для проверки пригодности хроматографической системы).

Средняя молекулярная масса 10% низкомолекулярной фракции декстрана. Значение для 10% низкомолекулярной фракции декстрана, которая элюируется в секции и после секции хроматограмм m, рассчитывают по формуле:

, (7)

где m определяется неравенствами:

, (8)

, (9)

где: p - количество секций, на которые разделена хроматограмма;

y_i - высота хроматографической линии над базовой линией для секции i;

M_i - молекулярная масса для секции i.

Результаты анализа считаются достоверными, если полученное значение для 10% низкомолекулярной фракции декстрана находится в пределах:

- от 6000 до 8500 (для СО ФЕАЭС декстрана 40 для проверки пригодности хроматографической системы);

- от 7000 до 11 000 (для СО ФЕАЭС декстрана 60/70 для проверки пригодности хроматографической системы).

МОЛЕКУЛЯРНО-МАССОВОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ИСПЫТУЕМОГО ДЕКСТРАНА

Хроматографируют выбранный объем испытуемого раствора и рассчитывают: значение M_w для молекулярно-массового распределения декстрана, значение M_w для 10% высокомолекулярной фракции декстрана и значение M_w для 10% низкомолекулярной фракции декстрана рассчитывают, как описано в разделе "Пригодность хроматографической системы".

201020050-2022

2.1.2.50. Круговой дихроизм

При прохождении плоскополяризованного света через оптически активное вещество вблизи его полос поглощения происходит аномальное изменение угла вращения плоскости поляризованного света, что приводит к круговому дихроизму.

Круговым дихроизмом называют разность поглощений, присущую оптически активным веществам в пределах полосы поглощения для света с левой и правой круговой поляризацией.

Из линейно поляризованного световой луч становится при выходе из раствора оптически активного вещества эллиптически поляризованным, причем эллиптичность проходит через максимум в области полосы поглощения (эффект Коттона).

Поглощение кругового дихроизма определяется прямым измерением поглощения света с левой и правой круговой поляризацией:

,

где: A_L - поглощение света с левой круговой поляризацией;

A_R - поглощение света с правой круговой поляризацией.

Круговой дихроизм рассчитывают по формуле:

,

где: - молярный круговой дихроизм или молярный дифференциальный дихроичный коэффициент поглощения, л · моль^-1 · см^-1;

- молярный коэффициент поглощения (2.1.2.24) для света с левой круговой поляризацией;

- молярный коэффициент поглощения для света с правой круговой поляризацией;

c - молярная концентрация вещества в испытуемом растворе, моль · л^-1;

l - длина оптического пути, см.

Для характеристики кругового дихроизма могут быть также использованы следующие величины:

Коэффициент диссимметрии:

,

где: - молярный коэффициент поглощения (2.1.2.24).

Молярная эллиптичность:

Молярной эллиптичностью называют величину угла в градусах для 1 M раствора оптически активного вещества при длине оптического пути 1 м. Молярная эллиптичность может быть рассчитана по показаниям приборов (дихрографов), непосредственно измеряющих величину эллиптичности в градусах, по формуле:

,

где: - молярная эллиптичность, градус · см² · дмоль^-1;

- значение эллиптичности, показываемое прибором;

M - молярная масса испытуемого вещества;

c - массовая концентрация вещества в испытуемом растворе, г · мл^-1;

l - длина оптического пути, см.

Молярная эллиптичность также связана с молярным круговым дихроизмом следующим уравнением:

.

Молярная эллиптичность часто используется при анализе белков и нуклеиновых кислот. В этом случае молярную концентрацию раствора рассчитывают с учетом средней относительной молекулярной массы элементарного звена белка или нуклеиновой кислоты, найденной по формуле:

,

где: M_r - относительная молекулярная масса белка или нуклеиновой кислоты;

N - число элементарных звеньев белка или нуклеиновой кислоты.

Средняя относительная молекулярная масса элементарного звена составляет для белков от 100 до 120 (в среднем 115), для нуклеиновых кислот (в виде натриевой соли) - около 330.

Прибор. Источником света (S) является ксеноновая лампа (рисунок 2.1.2.50.-1); свет проходит через двойной монохроматор (M), снабженный кварцевыми призмами (P1, P2).

Рисунок 2.1.2.50.-1. - Оптическая схема дихрографа

Линейный луч из первого монохроматора расщепляется на 2 компонента, поляризуемые под правым углом вторым монохроматором. Дополнительный луч устраняется выходной щелью монохроматора.

Поляризованный и монохроматический свет проходит через двоякопреломляющий модулятор (Cr); в результате образуется переменный свет с круговой поляризацией.

Затем луч проходит через исследуемый образец (C) и попадает на фотоумножитель (P.M.), за которым следует усилитель, производящий 2 электрических сигнала: один - постоянного тока V_c, а другой - переменного тока с частотой модуляции V_ac, характерной для исследуемого образца. Фаза является показателем кругового дихроизма. Отношение V_ac/V_c пропорционально дифференциальной оптической плотности , которая создается сигналом. Дихрограф обычно позволяет проводить измерения в диапазоне длин волн от 170 нм до 800 нм.

КАЛИБРОВКА ПРИБОРА

Точность шкалы оптической плотности. 10,0 мг изоандростерона P растворяют в диоксане P и доводят тем же растворителем до объема 10,0 мл. Снимают спектр кругового дихроизма раствора в диапазоне от 280 нм до 360 нм. Величина , измеренная в максимуме при 304 нм, равна +3,3.

Допускается использование раствора (1S)-(+)-10-камфорсульфоновой кислоты P.

Линейность модуляции. 10,0 мг (1S)-(+)-10-камфорсульфоновой кислоты P растворяют в воде P и доводят тем же растворителем до объема 10,0 мл. Определяют точную концентрацию камфорсульфоновой кислоты в растворе методом спектрофотометрии в ультрафиолетовой области (2.1.2.24), используя значение удельного показателя поглощения при 285 нм, равное 1,49.

Снимают спектр кругового дихроизма раствора в диапазоне от 185 нм до 340 нм. Величина , измеренная в максимуме при 290,5 нм, составляет от +2,2 до +2,5, а измеренная в максимуме при 192,5 нм - от -4,3 до -5.

Допускается использование аммония (1S)-(+)-10-камфорсульфоната P или его оптического изомера аммония (1R)-(-)-10-камфор-сульфоната P.

201020051-2022

2.1.2.51. Масс-спектрометрия

Масс-спектрометрия основана на прямом измерении отношения массы к числу элементарных положительных или отрицательных зарядов ионов (m/z), полученных из анализируемого образца, находящихся в газовой фазе. Данное отношение выражается в атомных единицах массы (1 а.е.м. = одной двенадцатой массы нуклида ¹²C) или в дальтонах (1 Да = массе атома водорода).

Ионы, образовавшиеся в ионизаторе прибора, ускоряются и перед попаданием в детектор разделяются с помощью масс-анализатора. Все эти действия происходят в камере, в которой насосная система поддерживает вакуум от 10^-3 до 10^-6 Па.

Результирующий масс-спектр является графиком зависимости относительного количества различных ионов от отношения m/z. Сигнал, отвечающий иону, представлен несколькими пиками, соответствующими статистическому распределению различных изотопов этого иона. Такая диаграмма называется изотопным профилем, а пик (по крайней мере, для небольших молекул), представляющий наиболее распространенные изотопы для каждого атома, - моноизотопным пиком.

Масс-спектрометрический анализ дает важную качественную (определение молекулярных масс; информация, касающаяся структуры определяемых фрагментов) и количественную (с использованием внешнего или внутреннего стандартов) информацию с пределом обнаружения от пикомоля до фемтомоля.

ВВОД ОБРАЗЦА

Первой стадией анализа является ввод образца в прибор без значительного нарушения вакуума. В широко распространенном методе, называемом прямым вводом жидкости, образец помещается на конце цилиндрического штока (в кварцевом тигле, на проволоке или на металлической поверхности). Этот шток через вакуумный шлюз, в котором поддерживается первичный промежуточный вакуум между атмосферным давлением и вторичным вакуумом прибора, вводится в спектрометр.

Другие системы ввода позволяют проанализировать компоненты смеси, которые разделяются с помощью соответствующего прибора, соединенного с масс-спектрометром.

Газовая хроматография/масс-спектрометрия. При использовании подходящих колонок (капиллярных или полукапиллярных) возможно непосредственное введение конца колонки в ионизатор прибора без применения сепаратора.

Жидкостная хроматография/масс-спектрометрия. Такая комбинация особенно полезна для анализа полярных соединений, которые являются недостаточно летучими либо слишком термолабильными для того, чтобы их можно было проанализировать методом газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией. Данный метод осложняется трудностью получения ионов в газовой фазе из жидкой фазы, что требует применения специальных интерфейсов, таких, как:

- прямой ввод жидкости: подвижная фаза распыляется, и растворитель испаряется перед ионизатором прибора;

- интерфейс с пучком частиц: подвижная фаза, скорость которой может достигать 0,6 мл/мин, распыляется в десольватационной камере, в результате в ионизатор прибора попадают лишь определяемые вещества в нейтральной форме; данный способ может быть использован для соединений с относительно низкой полярностью и молекулярными массами менее 1000 Да;

- интерфейс с движущейся лентой: подвижная фаза, скорость которой может достигать 1 мл/мин, наносится на поверхность движущейся ленты; после выпаривания растворителя, анализируемый образец переносится к ионизатору прибора, где подвергается ионизации; данный способ мало эффективен для сильно полярных или термолабильных соединений.

Другие виды интерфейсов (электрораспыление, термораспыление, химическая ионизация при атмосферном давлении) могут рассматриваться как самостоятельные методы ионизации и описаны в разделе, посвященном способам ионизации.

Сверхкритическая флюидная хроматография/масс-спектрометрия. Подвижная фаза, обычно состоящая из находящегося в сверхкритическом состоянии углерода диоксида, переходит в газообразное состояние после прохождения через нагретую заслонку, находящуюся между колонкой и ионизатором.

Капиллярный электрофорез/масс-спектрометрия. Элюент вводится в ионизатор, в некоторых случаях после добавления дополнительного растворителя, для достижения скорости потока порядка нескольких миллилитров в минуту. Ограничениями данного метода являются малые количества вводимого образца и необходимость использования летучих буферных растворов.

СПОСОБЫ ИОНИЗАЦИИ

Электронный удар. Образец, находящийся в газообразном состоянии, ионизируется потоком электронов, энергия которых (обычно 70 эВ) больше энергии ионизации образца. При этом кроме молекулярного иона M⁺ образуются осколочные ионы, характерные для данной молекулярной структуры. Главным ограничением данного способа является необходимость испарения образца, что делает невозможным его применение для полярных, термолабильных или высокомолекулярных соединений. Ионизация электронным ударом может быть использована в газовой хроматографии, соединенной с масс-спектрометрией, а в некоторых случаях и в жидкостной хроматографии.

Химическая ионизация. Этот тип ионизации предполагает использование газа-реактива, такого, как метан, аммиак, азота монооксид, азота диоксид или кислород. Спектр характеризуется ионами (M + H)⁺ или (M - H)^- типов или ионами-аддуктами, образованными из образца и используемого газа. Осколочные ионы образуются реже, чем при ионизации электронным ударом. Для термолабильных веществ используется разновидность данного метода ионизации, при которой образец, находящийся на проволоке, очень быстро испаряется вследствие эффекта Джоуля-Томсона (десорбционная химическая ионизация).

Бомбардировка быстрыми атомами (FAB) или ионизация бомбардировкой быстрыми ионами (жидкостная масс-спектрометрия вторичных ионов - LSIMS). Образец, растворенный в вязкой матрице (например, в глицерине), наносится на металлическую поверхность и ионизируется потоком нейтральных атомов, например, аргона, ксенона или обладающими большой кинетической энергией ионами цезия. Образуются ионы (M + H)⁺ или (M - H)^- типов либо ионы-аддукты, сформированные матрицей или образцом. Данный тип ионизации подходит для полярных, термолабильных соединений, имеющих молекулярную массу до 10 000 Да. При прибавлении к подвижной фазе от 1% до 2% глицерина он может быть использован для жидкостной хроматографии, однако скорость подвижной фазы должна быть очень низкой (несколько микролитров в минуту). При нанесении тонкого слоя матрицы на поверхность хроматографических пластинок такой способ ионизации допускается использовать и в тонкослойной хроматографии.

Полевая десорбция или полевая ионизация. Образец испаряется около вольфрамовой проволоки, покрытой микроиглами (полевая ионизация) или помещается на эту проволоку (полевая десорбция). Сильное электрическое поле (напряжение около 10 кВ), возникающее между проволокой и противоэлектродом, ионизирует образец. При данных способах ионизации образуются преимущественно молекулярные ионы M⁺ и (M + H)⁺ ионы. Эти способы используются для малополярных и (или) термолабильных соединений.

Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация (MALDI). Образец, смешанный с подходящей матрицей и помещенный на металлическую подложку, ионизируется импульсным лазерным излучением с длиной волны от УФ- до ИК-диапазона (продолжительность импульсов может составлять от пикосекунды до нескольких наносекунд). Данный способ ионизации играет важную роль при анализе соединений с молекулярной массой более 100 000 Да, но ограничен использованием времяпролетного анализатора (см. ниже).

Электрораспылительная ионизация. Данный способ ионизации проводится при атмосферном давлении. Образец, находящийся в растворе, вводится в источник через капилляр, конец которого имеет потенциал порядка 5 кВ. Для облегчения распыления может использоваться газ. Испарение молекул растворителя из образующихся микрокапель приводит к образованию в газовой фазе однозарядных или многозарядных ионов. Скорости подвижной фазы при данном виде ионизации могут изменяться от нескольких микролитров в минуту до 1 мл/мин. Такая ионизация подходит для полярных соединений, а также для исследования биомолекул с молекулярными массами до 100 000 Да. Она может сочетаться с жидкостной хроматографией или капиллярным электрофорезом.

Химическая ионизация при атмосферном давлении (APCI). Ионизация проводится при атмосферном давлении под действием электрода, имеющего потенциал несколько киловольт и помещенного на пути подвижной фазы, которая распыляется как вследствие тепловых эффектов, так и благодаря использованию потока азота. Образующиеся ионы являются однозарядными и относятся к (M + H)⁺ типу в случае положительного заряда и к (M - H)^- типу в случае отрицательного. Возможность использования высоких скоростей подвижной фазы (до 2 мл/мин) делает этот способ ионизации идеальным для сочетания с жидкостной хроматографией.

Термораспылительная ионизация. Образец, находящийся в подвижной фазе, состоящей из воды и органических модификаторов и содержащей летучий электролит (обычно ацетат аммония) вводится в распыленной форме после прохождения через металлический капилляр, температура которого контролируется. Допускаются скорости подвижной фазы порядка 1 - 2 мл/мин. Ионы электролита ионизируют анализируемое соединение. Такой процесс ионизации может быть заменен или усилен электрическим разрядом напряжением около 800 В, особенно при использовании только органического растворителя. Данный способ ионизации может быть использован в методе жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией.

АНАЛИЗАТОРЫ

Различия в работе анализаторов зависят, главным образом, от двух параметров:

- диапазона, в котором могут быть измерены отношения m/z (массовый диапазон);

- разрешающей способности, характеризующееся возможностью разделить два иона одинаковой интенсивности с отношениями m/z, отличающимися на и перекрывающиеся при определенном процентном превышении базовой линии; например, разрешающая способность , равная 1000 с 10% превышением базовой линии, позволяет провести разделение отношений m/z 1000 и 1001 с интенсивностями, на 10% превышающими базовую линию. В некоторых случаях (времяпролетные анализаторы, квадрупольные анализаторы, ионные ловушки) разрешающая способность может быть определена как отношение между молекулярной массой и шириной пика на половине высоты (50% превышение базовой линии).

Магнитные и электростатические анализаторы. Ионы, образовавшиеся в ионизаторе, ускоряются потенциалом V и сосредотачиваются, в зависимости от устройства прибора, между магнитным (магнитное поле B) или электростатическим анализаторами (электростатическое поле E). В соответствии с законом Лапласа они перемещаются по траектории с радиусом r:

.

Для накопления и измерения различных ионов, образовавшихся в ионизаторе, могут быть использованы два типа сканирования: изменение B при постоянной величине V или изменение V при постоянной величине B. За магнитным анализатором обычно следует электрический сектор, который действует как фильтр кинетической энергии и позволяет заметно увеличить разрешающую способность прибора. Максимальная разрешающая способность такого прибора (двойной сектор) изменяется от 10 000 до 150 000 и в большинстве случаев позволяет достаточно точно оценить величину отношений m/z для определения элементного состава соответствующих ионов. Для однозарядных ионов массовый диапазон составляет от 2000 Да до 15 000 Да. Некоторые ионы могут разрушаться спонтанно (метастабильные переходы) или при столкновении с газом (диссоциация, активированная столкновением (CAD)) в областях между ионизатором и детектором, где отсутствует поле. Исследование этих процессов разрушения очень полезно для определения структуры и характеристики определенного соединения, входящего в состав смеси, и делает возможным использование тандемной масс-спектрометрии. В зависимости от места, в котором протекают процессы разрушения, известно много методик его проведения:

- режим дочернего иона (определение состава ионов, образовавшихся при разрушении определенного родительского иона): B/E = константа, MIKES (Mass-analysed Ion Kinetic Energy Spectroscopy);

- режим родительского иона (определение всех ионов, образовавшихся при разрушении иона с определенным отношением m/z): B²/E = константа;

- режим нейтральных частиц (определение всех ионов, которые теряют идентичные фрагменты): B/E(1 - E/E₀)^1/2 = константа, где E₀ - базовый потенциал электрического сектора.

Квадрупольные анализаторы. Анализатор состоит из четырех параллельных металлических стержней, имеющих цилиндрическое или гиперболическое поперечное сечение. Они расположены симметрично по отношению к траектории движения ионов; пары противоположных стержней присоединены к электрическому источнику. Потенциалы двух пар стержней противоположны. Они состоят из постоянного и изменяющегося компонентов. Ионы, образовавшиеся в ионизаторе, пропускаются и разделяются вследствие изменения потенциалов, приложенных к стержням, причем отношение постоянного потенциала к переменному должно оставаться неизменным. Квадрупольные анализаторы обычно имеют массовый диапазон от 1 а.е.м. до 2000 а.е.м., хотя в некоторых случаях он может достигать 4000 а.е.м. Несмотря на то, что такие анализаторы имеют меньшее разрешение, чем магнитные, они позволяют получать моноизотопный профиль однозарядных ионов во всем массовом диапазоне. Для получения спектров можно использовать три квадруполя, соединенных друг с другом, Q₁, Q₂, Q₃ (Q₂ служит ионизационной камерой и в действительности не является анализатором; чаще всего в качестве ионизирующего газа применяют аргон).

Наиболее часто используемыми режимами сканирования являются:

- режим дочернего иона: Q₁ выбирает m/z ион, фрагменты которого, полученные при ионизации в квадруполе Q₂, анализируются квадруполем Q₃;

- режим родительского иона: Q₃ пропускает ионы только с определенным соотношением m/z, в то время как Q₁ сканирует определенный массовый диапазон. Детектируются только ионы, при разрушении которых образуется ион, отбираемый квадруполем Q₃;

- режим нейтральных частиц: Q₁ и Q₃ сканируют определенный массовый диапазон, но в интервале, соответствующем фрагментам, которые теряет определенное вещество или группа веществ.

Для получения спектров возможно сочетание квадрупольных анализаторов с магнитными или электростатическими. Такие приборы называют гибридными масс-спектрометрами.

Ионные ловушки. Данные анализаторы имеют такой же принцип работы, что и квадрупольные, но в них используются трехмерные электрические поля. Анализаторы такого типа позволяют получать спектры ионов нескольких генераций (MSⁿ).

Циклотронно-резонансные масс-анализаторы. Ионы, образовавшиеся в ячейке и подвергнутые действию интенсивного магнитного поля, движутся по круговым траекториям с частотами, которые могут быть непосредственно связаны с величинами отношений m/z для этих ионов при помощи Фурье преобразования. Данное явление называется ионно-циклотронным резонансом. Анализаторы такого типа состоят из сверхпроводящих магнитов и обладают очень высокой разрешающей способностью (до 1 000 000 и выше), а также позволяют получать MSⁿ спектры. Их недостатком является необходимость использования очень глубокого вакуума (порядка 10^-7 Па).

Времяпролетные анализаторы. Ионы, образовавшиеся в ионизаторе, ускоряются потенциалом величиной от 10 кВ до 20 кВ. Они проходят через анализатор, состоящий из бесполевой трубы длиной от 25 см до 1,5 м, обычно называемой пролетной трубой. Время (t), за которое ион достигает детектора, пропорционально квадратному корню из отношения m/z. Теоретически массовый диапазон для такого анализатора бесконечен. Практически он определяется методом ионизации или десорбции. Времяпролетные анализаторы используются, главным образом, для высокомолекулярных соединений (вплоть до нескольких сотен тысяч дальтон). Данный анализатор обладает очень высокой чувствительностью (достаточно несколько пикомолей вещества). Точность измерений и разрешающая способность таких приборов могут быть значительно улучшены при использовании электростатического зеркала (рефлектрона).

ПОЛУЧЕНИЕ СИГНАЛА

Существует три возможных режима получения сигнала.

Режим полного спектра. Записывается полный сигнал, полученный для выбранного массового диапазона. Спектр представляет собой зависимость относительной интенсивности различных ионов от величины m/z. Получаемые результаты являются главным образом качественными. Для более быстрой идентификации возможно использование библиотек спектров сравнения.

Фрагментометрический режим (селективное сканирование ионов). Получаемый сигнал ограничен одним (сканирование одного иона, single-ion monitoring (SIM)) или несколькими (множественное ионное сканирование, multiple-ion monitoring (MIM)) ионами, характерными для анализируемого вещества. В этом режиме предел обнаружения значительно ниже. При использовании внутреннего или внешнего стандартов (например, дейтерированные стандарты) могут быть проведены количественные или полуколичественные измерения. При использовании времяпролетных анализаторов такие измерения невозможны.

Двойной фрагментометрический масс-спектрометрический режим (множественный мониторинг реакций, multiple reaction monitoring (MRM)). Включает специфическую мономолекулярную или бимолекулярную реакцию разрушения выбранного иона-предшественника, характерного для анализируемого вещества. Селективность и высокая специфичность данного режима получения сигнала обеспечивают превосходную чувствительность и делают его наиболее подходящим для количественных определений с использованием подходящих внутренних стандартов (например, дейтерированных). Данный вид анализа может быть проведен только при использовании приборов, снабженных тремя соединенными квадруполями, ионными ловушками или циклотронно-резонансными анализаторами.

КАЛИБРОВКА

Калибровка позволяет установить соответствие между величиной m/z и детектируемым сигналом. Как правило, она проводится с использованием вещества сравнения. Калибровка может быть внешней (данные находятся в отдельном файле) или внутренней (вещество (вещества) сравнения смешивается с исследуемым веществом и результаты вносятся в файл с данными анализа). Число ионов или точек, необходимое для надежной калибровки, зависит от типа анализатора и требуемой точности измерений, например, в случае магнитного анализатора, где отношение m/z экспоненциально изменяется при изменении величины магнитного поля, необходимо брать настолько много точек, насколько это возможно.

ОБНАРУЖЕНИЕ СИГНАЛА И ОБРАБОТКА ДАННЫХ

Ионы, разделенные анализатором, преобразуются в электрические сигналы такими детектирующими системами, как фотоумножитель или электронный умножитель. Затем данные сигналы усиливаются и превращаются в цифровые сигналы, которые используются при обработке данных и позволяют проводить различные операции: калибровку, получение спектров, автоматические количественные расчеты, архивирование данных, создание или использование библиотек масс-спектров. Различные физические параметры, требуемые для работы прибора, в целом контролируются компьютером.

201020052-2022

2.1.2.52. Сверхкритическая флюидная хроматография

Сверхкритическая флюидная хроматография (СФХ) - это метод хроматографического разделения, в котором подвижной фазой является жидкость (флюид), находящаяся в сверхкритическом или субкритическом состоянии. В этом состоянии свойства вещества являются промежуточными между свойствами газа и жидкости. Неподвижная фаза, содержащаяся в колонке, состоит либо из тонко измельченных твердых частиц, таких как силикагель или пористый графит, химически модифицированной неподвижной фазы, используемой в жидкостной хроматографии, либо, в случае капиллярных колонок, поперечно-сшитой жидкой пленки, равномерно нанесенной на стенки колонки.

СФХ основана на механизмах адсорбции или распределения по массе.

С точки зрения применения флюида в качестве подвижной фазы в хроматографии важны его плотность, коэффициенты диффузии и вязкость:

- коэффициенты диффузии в сверхкритических фазах примерно на порядок больше коэффициентов диффузии в жидкостях, но примерно на порядок меньше, чем в газах;

- вязкость сверхкритических флюидов примерно на порядок меньше, чем жидкостей, но примерно на порядок больше, чем газов;

- растворяющая способность веществ в состоянии сверхкритического флюида больше, чем у газов;

- плотность основных флюидов, используемых в хроматографии, примерно на 2 - 3 порядка больше плотности газов и в несколько раз меньше плотности соответствующих жидкостей.

Применительно к сверхкритической флюидной хроматографии это означает что:

- достигаются меньшие времена анализа по сравнению с высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ);

- оптимальное значение линейной скорости потока выше, чем в ВЭЖХ;

- падение давления на колонке значительно меньше, чем в ВЭЖХ, что дает возможность использования колонок большей длины;

- хроматографическая эффективность в сверхкритической флюидной хроматографии выше, чем в ВЭЖХ (хотя и ниже, чем в газовой хроматографии);

- возможно проведение разделения при более низких температурах, чем это принято в газовой хроматографии без существенной потери эффективности;

- возможно проведение разделения соединений с большей молекулярной массой, чем это допускается в газовой хроматографии.

ПРИБОР

Прибор обычно состоит из охлаждаемой насосной системы, устройства для ввода проб (инжектора), хроматографической колонки, помещенной в термостат, детектора, автоматического регулятора давления и регистрирующего устройства сбора данных.

Насосная система

Насосная система необходима для поддержания постоянной скорости подвижной фазы. Колебания давления должны быть сведены к минимуму, например, путем пропускания сжатого растворителя через устройство, подавляющее пульсацию. Трубы и соединения способны выдерживать давление, создаваемое насосной системой.

Точная доставка подвижной фазы при постоянных или изменяющихся по определенной программе условиях осуществляется системами, контролируемыми микропроцессором. В случае градиентного элюирования могут быть использованы насосные системы, доставляющие растворитель(и) из нескольких резервуаров. Смешивание растворителей может быть достигнуто как со стороны насоса(ов), имеющего низкое давление, так и со стороны насоса(ов), имеющего(их) высокое давление.

Устройство для ввода проб (инжекторы)

Ввод пробы осуществляется непосредственно в колонку с помощью специального крана-дозатора.

Неподвижные фазы

Неподвижные фазы находятся в колонках, описанных в разделах общих фармакопейных статей 2.1.2.28. Высокоэффективная жидкостная хроматография (набивные колонки) и 2.1.2.27. Газовая хроматография (капиллярные колонки). Максимальный внутренний диаметр капиллярной колонки составляет 100 мкм.

Подвижные фазы

Обычно в качестве подвижной фазы используют углерода диоксид, который может содержать полярный модификатор, например, метанол, 2-пропанол или ацетонитрил. Состав, давление (плотность), температура и скорость потока подвижной фазы, указанные в частной фармакопейной статье или нормативном документе по качеству, могут быть либо постоянными в течение всего хроматографического процесса (изократическое, изотермическое элюирование, элюирование при постоянной плотности), либо изменяться по определенной программе (градиентное элюирование модификатора, давление (плотность), температура или скорость потока).

В качестве других подвижных фаз допускается использование азота (I) оксида, аммиака, метанола, н-бутана, диэтилового эфира, дифтордихлорметана.

Детекторы

Наиболее часто используются спектрофотометрические детекторы, работающие в ультрафиолетовой и видимой областях (UV/Vis), масс-спектрометрический детектор и пламенно-ионизационные детекторы. Допускается использование детекторов по светорассеянию, ИК-спектрофотометров, детекторов по теплопроводности или других специальных детекторов.

МЕТОДИКА

Испытуемый(ые) раствор(ы) и раствор(ы) сравнения готовят в соответствии с указаниями в частной фармакопейной статье и (или) нормативном документе по качеству.

Критерии оценки пригодности хроматографической системы описаны в общей фармакопейной статье 2.1.2.36. Хроматографические методы разделения. Пределы, в которых могут корректироваться параметры хроматографической системы для соответствия требованиям пригодности системы, также приведены в указанной общей фармакопейной статье.

201020053-2022

2.1.2.53. Рамановская спектрометрия

Рамановская спектрометрия (неупругое рассеяние света или спектрометрия комбинационного рассеяния - процесс рассеяния света, при котором испытуемый образец облучается интенсивным монохроматическим светом (обычно излучение лазера) и для света, рассеиваемого образцом, определяется сдвиг частоты.

Рамановская спектрометрия является дополнительным методом по отношению к ИК-спектрометрии в том смысле, что оба этих метода основаны на молекулярных колебаниях частиц испытуемого вещества. Однако рамановская и ИК-спектрометрия отличаются по относительной чувствительности для различных функциональных групп. Рамановская спектрометрия особенно чувствительна к неполярным связям (например, одинарные или кратные связи C-C), тогда как вода, для которой характерно сильное поглощение в ИК-области, обладает слабым рамановским рассеянием и поэтому хорошо подходит на роль растворителя в рамановской спектрометрии.

Прибор. Спектрометры для получения рамановских спектров обычно состоят из следующих компонентов:

- источник монохроматического света, чаще всего лазер с длиной волны в ультрафиолетовой, видимой или ближней инфракрасной области;

- подходящая оптика (линзы, зеркала, оптико-волоконные устройства), которые направляют возбуждающее излучение на образец и собирают свет, рассеиваемый образцом;

- оптическое устройство (монохроматор или фильтр), которое пропускает сдвинутое по частоте рамановское рассеяние и препятствует попаданию на детектор интенсивного света, частота которого равна частоте возбуждающего света (рэлеевское рассеяние);

- диспергирующее устройство (дифракционная решетка или призма), соединенное со щелью, регулирующей длину волны, и детектором (обычно фотоумножитель);

или:

- диспергирующее устройство (дифракционная решетка или призма), соединенное с многоканальным детектором (обычно прибор с зарядовой связью (ПЗС, CCD));

или:

- интерферометр с детектором, регистрирующий интенсивность рассеянного света во времени (например, компьютер и соответствующее программное обеспечение), и устройство обработки данных, которое с помощью Фурье-преобразования переводит данные в диапазон частот или волновых чисел.

ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦА

Рамановские спектры могут быть получены для твердых веществ, жидкостей и газов, причем как помещенных в стеклянные контейнеры или трубки, как правило, без предварительной подготовки образца или растворения, так и напрямую.

Основным ограничением рамановской спектрометрии является флуоресценция примесей, которая мешает детектору улавливать значительно более слабый рамановский сигнал. Флуоресценции можно избежать при использовании в качестве возбуждающего света лазерного излучения с большой длиной волны, например, находящейся в ближней инфракрасной области. Интенсивность некоторых рамановских линий может быть усилена несколькими способами, например, путем использования резонансной рамановской спектрометрии (RR) или поверхностно-усиленной рамановской спектрометрии (SERS).

Из-за узости светового потока падающего лазерного излучения для получения спектра необходимо всего лишь несколько микролитров образца. Тем не менее следует учитывать неоднородность образца, если только его объем не увеличен, например, путем вращения.

ИДЕНТИФИКАЦИЯ И КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СТАНДАРТНЫХ ОБРАЗЦОВ

Испытуемый образец и стандартный образец подвергают одинаковой обработке и затем при одинаковых условиях получают их спектры. Максимумы в спектре испытуемого образца должны совпадать по расположению и интенсивности с соответствующими максимумами в спектре стандартного образца Фармакопеи Евразийского экономического союза (СО ФЕАЭС). Если спектры, полученные для твердых веществ, имеют различия в положениях максимумов, испытуемый образец и стандартный образец подвергают одинаковой обработке для того, чтобы они выкристаллизовались или образовались в одинаковой форме, либо поступают так, как описано в частной фармакопейной статье, и затем снимают спектры.

Поскольку закон Бера-Ламберта для рамановской спектроскопии не выполняется, интенсивность рамановского излучения прямо пропорциональна концентрации рассеивающих частиц. Как и в случае других спектроскопических методов, количественное определение может быть проведено с использованием известных количеств или концентраций стандартных образцов. Вследствие небольшого пространственного разрешения метода следует обращать внимание на качество испытуемых образцов и стандартных образцов - например, необходимо быть уверенным в том, что они находятся в одном и том же физическом состоянии либо использовать внутренний стандарт для жидких образцов.

ИДЕНТИФИКАЦИЯ И КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СПЕКТРАЛЬНЫХ БИБЛИОТЕК И СТАТИСТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ДЛЯ КЛАССИФИКАЦИИ И КАЛИБРОВКИ

Контроль за работой прибора. При использовании прибора следуют инструкциям производителя; регулярно, в зависимости от применения прибора и испытуемых образцов, проводят предписанные калибровки и испытания работы системы. При использовании рамановской спектрометрии для количественных определений либо при создании спектральных библиотек сравнения для (хемометрической) классификации или калибровки необходимо обращать особое внимание на то, чтобы были сделаны все поправки к измерениям либо предприняты меры для контроля за изменяемостью величин волновых чисел и интенсивности сигнала прибора.

Проверка шкалы волновых чисел. Шкалу волновых чисел рамановских сдвигов (обычно выражаемую в обратных сантиметрах) проверяют с помощью подходящих стандартов, которые имеют характерные максимумы при исследуемых величинах волновых чисел (например, органическое вещество, неоновая лампа или линии Ar⁺ плазмы из аргон-ионного лазера).

Калибровка прибора должна соответствовать типу образца, т.е. для твердых испытуемых образцов следует использовать твердые стандартные образцы, а для жидких - жидкие. Выбирают подходящее вещество (например, полистирол, парацетамол, циклогексан), для которого установлены точные значения сдвигов волновых чисел.

Таблица 2.1.2.53.-1. - Сдвиги волновых чисел (и допустимые отклонения) для полистирола, парацетамола и циклогексана

--------------------------------

<1> Используют полистирольную пленку (например, толщиной 76 мкм), гранулы или стержень.

<2> СО ФЕАЭС парацетамола для квалификации оборудования, представляющий собой моноклинальную форму I.

<3> Циклогексан P.

<4> Не применимо в связи с выходом за пределы диапазона детектора.

Проверка шкалы интенсивностей. На абсолютную и относительную интенсивность рамановских полос могут оказывать влияние следующие факторы:

- поляризация падающего света;

- поляризация собирающей оптики;

- интенсивность падающего света;

- различия в отклике прибора;

- различия в фокусе и геометрии образца;

- различия в насыпной плотности для твердых образцов;

- показатель преломления n или изменение n между образцом и окружающей средой;

- размер частиц и распределение частиц по размерам;

- сечение рассеяния;

- сечение поглощения.

Подходящие критерии приемлемости могут изменяться в зависимости от применения, но в большинстве случаев допустимы колебания (изо дня в день) в относительных интенсивностях полос +/- 10%.

Создание спектральных библиотек сравнения. Снимают спектры подходящего числа полностью исследованных (например, так, как описано в частной фармакопейной статье) веществ, имеющих отличия в производителе, серии, кристаллической модификации, размерах частиц и т.д., типичные для анализируемого материала. Набор спектров дает информацию, определяющую границы подобия или количественного определения, которые могут быть использованы для того, чтобы, например, идентифицировать вещество или проконтролировать его количество, образовавшееся в процессе производства. Количество веществ в базе данных зависит от особенностей ее применения. Подходящее математическое преобразование спектра рассеяния может облегчить качественное сравнение спектров (например, коррекция базовой линии, нормализация минимума-максимума, нормализация вектора, производные).

Селективность базы данных, которая позволяет уверенно идентифицировать конкретное вещество или отличить его от других материалов базы данных, устанавливается во время валидации. Для уверенности в пригодности базы данных эта селективность должна регулярно проверяться; в особенности это необходимо делать после любых значительных изменений, произошедших с веществом (например, изменения поставщика или производственного процесса), либо при настройке прибора для рамановской спектрометрии (например, при проверке шкалы волновых чисел или повторяемости отклика спектрометра)

Полученная таким образом спектральная библиотека пригодна только для данного прибора либо аналогичного при условии подтверждения достоверности работы библиотеки после переноса.

Методика. Подготовку и исследование образца проводят таким же образом, как и при создании базы данных. Для облегчения сравнения спектров и количественных расчетов могут быть использованы подходящие математические преобразования рамановских спектров.

Сравнение или преобразования спектров, количественный прогноз свойств веществ, находящихся в испытуемом образце, могут проводиться с использованием подходящих методов хемометрики, статистической классификации и калибровки.

201020054-2022

2.1.2.54. Методы вискозиметрии с падающим и катящимся шариками

Определение динамической вязкости ньютоновских жидкостей проводят, используя вискозиметр с падающим шариком или катящимся шариком, при температуре (20,0 +/- 0,1) °C, при отсутствии в частной фармакопейной статье других указаний температур. Измеряют время падения или движения шарика в испытуемой жидкости от одной отметки или датчика вискозиметра до другой.

ВИСКОЗИМЕТР С ПАДАЮЩИМ ШАРИКОМ

Оборудование. Вискозиметр с падающим шариком состоит из стеклянной трубки, заключенной в кожух, который позволяет контролировать температуру; 6 шариков различной плотности и диаметра, изготовленных из стекла, железно-никелевого сплава или стали. Трубку фиксируют таким образом, чтобы отклонение от вертикальной оси составляло (10 +/- 1)°. На трубке имеются две метки, определяющие расстояние падения шарика. К промышленным вискозиметрам прилагаются таблицы со значениями постоянных, плотности шариков и данные по пригодности различных шариков для использования в предполагаемом диапазоне вязкости.

Методика. Чистую, сухую трубку вискозиметра, предварительно выдержанную при температуре (20,0 +/- 0,1) °C, заполняют испытуемой жидкостью, избегая образования пузырьков. Подбирают в трубку шарик для получения времени падения не менее 30 с с учетом предполагаемого диапазона вязкости. Закрывают трубку и термостатируют раствор при температуре (20,0 +/- 0,1) °C в течение не менее 15 мин. Вначале пропускают шарик между двумя метками без измерения времени падения, во второй раз измеряют время падения шарика с верхней до нижней метки секундомером с точностью до 1/5 секунды. Испытание повторяют не менее 3 раз для получения не менее 4 значений времени падения шарика. Результат считается достоверным, если время последовательных 2 падений не отличаются более, чем на 1,5%.

Используя среднее значение времени падения шарика рассчитывают динамическую вязкость (, мПа·с) по формуле:

,

где: k - постоянная вискозиметра, в мм²/с²;

- плотность используемого шарика, г/см³;

- плотность испытуемой жидкости, в г/см³, полученная умножением относительной плотности на 0,9982;

t - среднее время падения шарика между крайними метками, с.

АВТОМАТИЧЕСКИЙ ВИСКОЗИМЕТР С КАТЯЩИМСЯ ШАРИКОМ

Оборудование. Автоматический вискозиметр с катящимся шариком состоит из нескольких капилляров из стекла или других подходящих материалов с разными диаметрами, помещенных в термостатически контролируемый блок, позволяющий проводить точный контроль температуры; шариков из нержавеющей стали (необязательно имеющих покрытие) или других подходящих материалов; мотора-редуктора, который определяет местоположение капилляра под углом наклона от (10,0 +/- 0,2)° до (80,0 +/- 0,2)° от вертикальной оси. Прибор имеет не менее 2 датчиков для измерения времени движения шарика на заданном расстоянии. К промышленным вискозиметрам прилагаются таблицы со значениями их постоянных, плотности шариков и данные по пригодности различных капилляров для использования в предполагаемом диапазоне вязкости. Контроль температуры, контроль угла наклона, определение времени движения, повторы движений и расчет среднего значения и относительного стандартного отклонения выполняются программным обеспечением прибора.

Методика. Настраивают программное обеспечение таким образом, чтобы в результате проведения измерений получить 4 значения времени движения (2 цикла вперед/назад) и относительное стандартное отклонение не более 0,5%. Выбирают капилляр, шарик и угол наклона, подходящие для предполагаемого диапазона вязкости испытуемой жидкости, таким образом, чтобы время движения составляло не менее 20 секунд при перемещении на расстояние 100 мм или было пропорционально времени перемещения на другие расстояния. При отсутствии подключения вискозиметра к цифровому денситометру значение плотности испытуемой жидкости должно быть указано в программном обеспечении прибора. Чистый, сухой капилляр вискозиметра заполняют испытуемой жидкостью, избегая образования пузырьков. Начинают измерение незамедлительно после заполнения капилляра. Прибор автоматически рассчитывает динамическую вязкость (, мПа/с) и кинематическую вязкость (v, мм²/с).

201020055-2022

2.1.2.55. МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ С ИНДУКТИВНО-СВЯЗАННОЙ ПЛАЗМОЙ

Масс-спектрометрия с использованием индуктивно-связанной плазмы (МС-ИСП, ICP-MS - inductively coupled plasma-mass spectrometry) представляет собой метод, использующий индуктивно-связанную плазму (ИСП) в качестве ионизирующего источника. Основные принципы ИСП описаны в общей фармакопейной статье 2.1.2.41. Атомно-эмиссионная спектрометрия с индуктивно-связанной плазмой (АЭС-ИСП).

В МС-ИСП используется способность ИСП генерировать заряженные ионы элементов, входящих в состав образца. Полученные ионы направляют в масс-спектрометр, который разделяет их в соответствии с отношением масса/заряд (m/z). Большинство масс-спектрометров имеют квадрупольные или магнитные анализаторы. Ионы переносятся из плазмы в ионную оптику через два конуса (конусы пробоотборника и сепаратора, образующие область интерфейса). Ионная оптика состоит из электростатических линз, которые переносят ионы из пространства с атмосферным давлением к масс-фильтру с давлением 10^-8 Па или менее, поддерживаемым с помощью турбомолекулярного насоса. После фильтрации ионы с выбранным соотношением масса/заряд направляются на детектор (канальный электроумножитель, чашка Фарадея, диноды), где поток ионов конвертируется в электрические сигналы. Количественно элементы определяют по числу ионов, появляющихся и генерирующих электрические импульсы в единицу времени.

Система ввода образца и способы обработки данных аналогичны используемым в АЭС-ИСП.

ПРИБОР

Главными составляющими частями прибора являются:

- система ввода образца, состоящая из перистальтического насоса, подающего раствор с постоянной скоростью в распылитель;

- радиочастотный (РЧ) генератор;

- плазменная горелка;

- область интерфейса, включающая в себя конусы для переноса ионов в ионную оптику;

- масс-спектрометр;

- детектор;

- блок сбора данных.

ИНТЕРФЕРЕНЦИЯ

Наибольшей проблемой является массовая интерференция. Например, изобарические разновидности значительно перекрывают массовый сигнал искомых ионов, особенно в центральной части диапазона масс (например, 40 - 80 а.е.м.). Комбинация атомных ионов приводит к полиатомной или молекулярной интерференциям (то есть ⁴⁰Ar¹⁶O с ⁵⁶Fe или ⁴⁰Ar⁴⁰Ar с ⁸⁰Se). Матрица, в случае с некоторыми определяемыми элементами, также может вызывать интерференцию. Некоторые образцы оказывают влияние на образование капель или на температуру ионизации в плазме. Эти явления могут приводить к подавлению аналитического сигнала определяемого элемента, оказывая влияние на достоверность результата. Обойти физическую интерференцию можно, используя метод внутреннего стандарта или метод стандартных добавок. Выбор элемента, используемого в качестве внутреннего стандарта, зависит от исследуемого элемента: например, в качестве внутренних стандартов могут быть использованы ⁵⁹Co и ¹¹⁵In.

Основной характеристикой приборов МС-ИСП является разрешение, то есть эффективность разделения двух близких масс. С этой точки зрения приборы с квадрупольными анализаторами уступают приборам с магнитными анализаторами.

МЕТОД

ПРОБОПОДГОТОВКА И ВВОД ОБРАЗЦА

Пробоподготовка обычно включает в себя стадию разложения матрицы с помощью подходящего метода, например, в микроволновой печи. Кроме того, необходимо обеспечить попадание концентрации определяемого элемента разведением или концентрированием в рабочий диапазон прибора и получение раствора испытуемого образца, способного воспроизводимо распыляться.

Некоторые распылительные системы устойчивы к действию высоких концентраций кислот, но использование серной и фосфорной кислот может оказывать влияние на базовую линию ИСП-спектров. Более предпочтительным является использование азотной и хлороводородной кислот. Фтористоводородную кислоту можно использовать при наличии устойчивых к ней (например, из перфторалкоксиполимера) систем ввода образца и горелок. При выборе метода ввода образца учитывают требования по чувствительности, стабильности, скорости, размеру образца, устойчивости к коррозии и устойчивости к закупорке. В большинстве случаев подходит использование распылителя с поперечным потоком вместе с распылительной камерой и горелкой. Перистальтический насос подает испытуемый раствор и раствор сравнения со скоростью 20 - 1000 мкл/мин.

В случае использования органических растворителей необходимо обеспечить разделение кислорода и органических слоев.

ВЫБОР УСЛОВИЙ ПРОВЕДЕНИЯ АНАЛИЗА

При выборе условий проведения анализа следуют рекомендациям производителя прибора. Анализ водных растворов и органических растворителей обычно происходит при различных условиях. Надлежащим образом должны быть выбраны следующие аналитические параметры:

- подбор конусов (материал пробоотборника и сепаратора);

- скорости потоков газа-носителя (внешняя, промежуточная и внутренняя трубки горелки);

- мощность радиочастотного излучения;

- скорость насоса;

- должен быть осуществлен выбор одного или более изотопов измеряемого элемента (масса).

ВЫБОР ИЗОТОПОВ

Выбор изотопов осуществляют по нескольким критериям. Для получения максимальной чувствительности выбирают наиболее распространенный изотоп данного элемента. Кроме того, следует выбирать изотоп с минимальной интерференцией, вызываемой другими видами изотопов, присутствующими в матрице и в газе-носителе. В программном обеспечении производителей приборов МС-ИСП обычно присутствует информация об изобарической интерференции и интерференции, вызываемой полиатомными ионами, например, гидридными, оксидными, хлоридными и т.д.

КОНТРОЛЬ РАБОТОСПОСОБНОСТИ ПРИБОРА

Пригодность системы

Настройка прибора позволяет проверять и регулировать измерение перед введением образца. Точность определения масс прибором МС-ИСП проверяют с помощью раствора для настройки, содержащего несколько изотопов, охватывающих весь диапазон, например, ⁹Be, ⁵⁹Co, ⁸⁹Y, ¹¹⁵In, ¹⁴⁰Ce и ²⁰⁹Bi.

Записывают чувствительность и кратковременную и долговременную стабильность. Параметры прибора (состояние плазмы, параметры ионных линз и квадруполей) настраивают на получение максимально возможного числа обнаружений ионов.

Для подтверждения наблюдения приемлемого отклика в широком диапазоне масс разрешение и ось масс настраивают с использованием раствора, содержащего Li, Y и Tl.

Для уменьшения интерференции необходимо оценить эффективность разложения плазмой некоторых оксидов. Хорошими индикаторами являются отношения Ce/CeO и (или) Ba/BaO, требуемый уровень при этом должен составлять менее 3%.

Подавление образования двухзарядных ионов осуществляют с использованием Ba и Ce. Отношение сигнала двухзарядных ионов к определяемому элементу должно быть менее 2%.

Долговременную стабильность проверяют, измеряя стандарт в начале и в конце испытания образца, при этом проверяется влияние отложения солей в конусах на уменьшение сигнала во время испытания.

ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ

Методику, приведенную в частной фармакопейной статье или нормативном документе по качеству, верифицируют через определенное время для получения удовлетворительных результатов.

ЛИНЕЙНОСТЬ

Готовят и анализируют не менее четырех растворов сравнения, концентрация которых находится в пределах диапазона калибровки, и контрольный раствор. Проводят не менее пяти измерений.

Используя все полученные данные, рассчитывают линейное уравнение графика методом наименьших квадратов. Строят кривую регрессии, отмечая средние значения, измеренные значения и доверительный интервал калибровочного графика. Методика является пригодной при условии соблюдения следующих требований:

- коэффициент корреляции должен быть не менее 0,99;

- на калибровочном графике погрешности каждого калибровочного уровня должны быть распределены случайным образом.

Рассчитывают среднее значение и относительное стандартное отклонение для наименьшего и наибольшего калибровочного уровня.

В случае если отношение рассчитанного стандартного отклонения наименьшего и наибольшего калибровочного уровня менее 0,5 или более 2,0, то более точная оценка калибровочного графика может быть получена с использованием взвешенной линейной регрессии. Линейная и квадратичная весовая функции применяются к полученным данным для нахождения наиболее подходящей для использования весовой функции. Если средние значения при сравнении с калибровочным графиком проявляют отклонение от линейности, используют двухмерную линейную регрессию.

ПРАВИЛЬНОСТЬ

Предпочтительно верифицировать правильность с использованием сертифицированных стандартных образцов. Если это невозможно, проверяют открываемость.

Открываемость. В случае методик количественного определения открываемость должна быть от 90% до 110%. Для других определений, например для определения следовых количеств элемента, открываемость должна быть от 80% до 120% от теоретического значения. Открываемость может быть определена с использованием подходящего раствора сравнения (матричного раствора), содержащего известное количество определяемого элемента (средняя концентрация калибровочного графика).

ПОВТОРЯЕМОСТЬ

Повторяемость должна быть не более 3% для количественного определения и не более 5% для испытания на содержание примесей.

ПРЕДЕЛ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Удостоверяются, что предел количественного определения (например, определенный с использованием приближения ) ниже измеряемого значения.

201020056-2022

2.1.2.56. Анализ гликанов в гликопротеинах

1. ВВЕДЕНИЕ

Анализ гликанов - комплекс испытаний для исследования олигосахаридных цепей (гликанов) гликопротеинов. Он может включать в себя:

- анализ цельного гликопротеина;

- разделение и обнаружение гликоформ белка;

- анализ гликопептидов, полученных после ферментативной обработки гликопротеина;

- анализ отщепленных гликанов, полученных после химической или ферментативной обработки гликопротеина.

Анализ моносахаридов может служить дополнением к информации, полученной при анализе гликанов.

Гликозилирование может играть важную роль в проявлении лекарственным средством биологического происхождения его функциональных, фармакокинетических, фармакодинамических и иммуногенных свойств, а также его устойчивости. Гликозилирование, в отличие от транскрипции, является процессом ферментативной модификации, не имеющим матричного управления, результатом чего является гетерогенность гликанов. На гетерогенность также влияет процесс получения. Поэтому анализ гликанов гликопротеинов является важным испытанием для идентификации изменений в схеме гликозилирования гликопротеинов и (или) для наблюдения за стабильностью схемы гликозилирования при производстве.

Анализ гликанов может быть сравнительным методом, потому что полученная информация, при сравнении с аналогично анализируемым стандартным образцом, подтверждает соответствие испытуемого образца.

В данной общей фармакопейной статье представлены подходы, используемые для анализа гликанов, входящих в состав гликопротеинов и требования к использованию и валидации методов.

Анализ гликанов не является единым общим методом, а включает в себя применение определенных процедур и получение специфических профилей гликанов для каждого гликопротеина. Особые процедуры указываются в соответствующих частных фармакопейных статьях или нормативном документе по качеству.

1.1. ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ

Существует 3 вида ферментативного гликозилирования белков:

- N-гликозилирование: присоединение олигосахаридов через атом азота терминальной амидной группы аспарагина;

- O-гликозилирование: присоединение олигосахаридов через гидроксильные группы серина, треонина и (или) гидроксипролина;

- C-гликозилирование: присоединение к C2-углероду индольного цикла триптофана.

Присоединение без участия ферментов, также известное как гликирование, может происходить при инкубировании белков с восстанавливающими сахарами.

1.2. ГЕТЕРОГЕННОСТЬ ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЯ БЕЛКОВ

При производстве гликопротеинов может проявляться различная степень гетерогенности гликанов. Неоднородность может появиться в результате изменчивости:

- по степени занятости (полная, частичная, свободная);

- по типу (N- или O-опосредованное);

- по структуре олигосахарида (протяженность, разветвленность, тип соединения).

Неоднородность гликозилирования приводит к наличию набора гликоформ у каждого отдельного гликопротеина. Эти разновидности возникают из-за того, что процесс гликозилирования, в отличие от транскрипционных или трансляционных процессов биосинтеза, не имеет матричного управления и представляет собой процесс посттрансляционного изменения молекулы.

Структура гликозилирования в выбранной части зависит от многих факторов, включая присутствие ферментов гликозилтрансфераз и экзогликозидаз (зависящее от специализации клетки и (или) от степени ее развития), обнаруживаемых в аппарате Гольджи и в эндоплазматической ретикулярной сети клетки.

Процесс гликозилирования зависит также от структуры белка, процесса получения, экспрессии системы "хозяин-векторная ДНК" и от режима культивирования клеток.

2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЛИКАНОВ

Гетерогенность в гликозилировании может быть оценена четырьмя отдельными и взаимодополняющими методами:

- анализ интактного гликопротеина;

- анализ гликопептидов;

- анализ отщепленных гликанов;

- анализ моносахаридов.

В настоящей статье представлены методы и общие требования, применяемые для анализа гликанов в гликопротеинах, содержащих N- и O-связанные гликаны.

Анализ гликанов обычно представляет собой многоступенчатый процесс. Существует большое количество методик анализа гликанов, обусловленное разнообразием и сложностью гликановых структур, числом доступных методик и систем детектирования, а также широким выбором подходов, в зависимости от уровня необходимой информации.

На рисунке 2.1.2.56.-1 представлена схема аналитических методик анализа гликанов, которая может быть использована для выбранного подхода (подходов). Вследствие разнообразия и сложности структуры и происхождения гликанов, доступны различные вариации одних и тех же методик и условий.

Рисунок 2.1.2.56.-1. - Общая схема методик анализа гликанов. Условные обозначения: КЭ - капиллярный электрофорез; АОХ - анионообменная хроматография при высоких значениях pH с импульсным амперометрическим детектированием; ИЭФ - изоэлектрическое фокусирование; ЖХ - жидкостная хроматография; МС - масс-спектрометрия; ПГХ-хроматография с использованием пористого графитированного углерода; ДСН-ПААГ электрофорез - электрофорез с натрия додецилсульфатом в полиакриламидном геле.

Выделение и очистка. Выделение и очистка могут быть необходимы для анализа фармацевтических субстанций или для анализа лекарственных форм, содержащих мешающие вспомогательные вещества, и описываются в частных фармакопейных статьях или нормативном документе по качеству.

2.1. АНАЛИЗ ИНТАКТНЫХ ГЛИКОПРОТЕИНОВ

Анализ интактного гликопротеина предоставляет информацию о гликозилировании гликопротеина в целом.

В том случае, если молекула крупная и имеет многочисленные положения гликозилирования, этот подход дает ограниченное количество информации.

Могут использоваться такие методы, как капиллярный электрофорез (2.1.2.37) и масс-спектрометрия (2.1.2.51). Методы, с основу которых положены свойства, связанные с размером молекулы, такие как эксклюзионная хроматография (2.1.2.29) и электрофорез с натрия додецилсульфатом в полиакриламидном геле (2.1.2.30), могут предоставлять информацию о состоянии гликозилирования белка. Если степень сиалирования значительно влияет на биологическую активность гликопротеина, то для ее мониторинга могут быть использованы ионообменная хроматография (2.1.2.36), изоэлектрическое фокусирование (2.1.2.38) или капиллярный электрофорез (2.1.2.37). Должна быть выбрана методика, обеспечивающая достоверную корреляцию между степенью сиалирования и биологической активностью продукта.

2.2. АНАЛИЗ ГЛИКОПЕПТИДОВ

Анализ гликопептидов обеспечивает получение информации о свойствах гликозилирования, характерных для данного участка молекулы, степени занятости и о структуре олигосахаридов. Он включает протеолитическое расщепление гликопротеинов. Подходы к расщеплению белкового остова в зависимости от местоположения представлены в общей фармакопейной статье 2.1.2.39. Пептидное картирование.

После протеолиза гликопротеина могут быть выбраны следующие подходы.

Прямой анализ методом масс-спектрометрии (2.1.2.51). Необходимо тщательно следить, чтобы сигнал гликопептида не подавлялся присутствием других пептидов, так как гликопептиды составляют малую долю в общей смеси пептидов и интенсивность сигнала у них меньше, чем у негликозилированных пептидов.

Разделение, предшествующее анализу методом масс-спектрометрии. Эта дополнительная стадия помогает преодолеть проблемы, упомянутые выше. Методы обогащения и фракционирования могут сочетаться с прямым анализом как параллельно, так и последовательно. Такие методы разделения как жидкостная хроматография (2.1.2.28) и капиллярный электрофорез (2.1.2.37) также пригодны. Эти методы могут быть совмещены с методом масс-спектрометрии, позволяя получать результаты в режиме реального времени (on-line).

Дегликозилирование гликопептидов. Сравнение пептидных карт, полученных после протеолитического расщепления интактного гликопротеина и дегликозилированного до или после протеолитического расщепления, дает возможность идентифицировать различные молекулы. Пептидная масса предоставляет информацию о гликозилированных участках и с помощью подсчета разницы масс между интактным и дегликозилированным гликопептидом можно получить информацию о составе и гетерогенности присоединенных гликанов. Способы дегликозилирования белкового остова представлены в разделе 2.3.1 данной общей фармакопейной статьи. Стадия разделения может быть проведена до или после дегликозилирования.

2.3. АНАЛИЗ ОТЩЕПЛЕННЫХ ГЛИКАНОВ

Проведение анализа отщепленных гликанов позволяет получать информацию о многообразных семействах гликанов, связанных с белком (профилирование по характеру ветвления: двойное, тройное или более высокого порядка). На этой стадии определяют также степень сиалирования. В зависимости от выбранного метода, для детектирования гликанов может быть необходима предварительная дериватизация/мечение.

Анализ отщепленных гликанов обычно включает в себя отщепление и выделение гликанов из реакционной смеси, сопровождающиеся с последующим маркированием и (или) дериватизацией гликанов (где это необходимо), после чего гликаны профилируют в соответствии со специфическими свойствами (фракционирование или разделение).

2.3.1. Отщепление гликанов

Выбор метода отщепления гликанов зависит от природы гликопротеина. Выбор реактива, применяемого для отщепления, зависит от выбора типа отщепления и от объема той информации, которая должна быть получена в результате испытания: может применяться ферментативное или химическое отщепление. В таблице 2.1.2.56.-1 представлен неполный перечень реактивов ферментативного отщепления и их субстратная специфичность.

Таблица 2.1.2.56.-1. - Перечень реактивов ферментативного отщепления и их субстратная специфичность