Тесты для установления диагноза муковисцидоз

- Рекомендуется проведение скрининга новорожденных на муковисцидоз (неонатальный скрининг, комплекс исследований для диагностики муковисцидоза), так как раннее выявление и своевременное начало терапии позволяет предупредить развитие тяжелых осложнений, улучшает показатели физического развития, замедляет темпы снижения функции легких, снижает потребность в госпитализации [1, 44, 45, 12, 23, 2, 15, 46].

(УУР - B, УДД - 2).

Комментарий: Проводится в Российской Федерации у всех новорожденных.

Протокол скрининга в РФ включает 3 обязательных этапа: ИРТ1, ИРТ2, потовая проба (таблица 8). На первом этапе в крови новорожденных (4 - 5 день у доношенных, 7 - 8 день у недоношенных) определяется уровень ИРТ. Взятие образцов крови осуществляется в соответствии с Приказом N 185 от 22.03.2006 "О массовом обследовании новорожденных детей на наследственные заболевания". При превышении порогового уровня ИРТ проводится ретест на 21 - 28 день жизни. При положительном ретесте проводится потовая проба. Позитивная потовая проба расценивается как положительный результат скрининга, и пациента направляют в Центр муковисцидоза (либо профильное отделение). Дети с мекониевым илеусом независимо от уровня ИРТ нуждаются в проведении потовой пробы из-за возможного у них ложно отрицательного результата [2, 15].

Оптимальные сроки установки диагноза и начала наблюдения пациента, выявленного по программе неонатального скрининга - первые 2 месяца жизни [2, 15].

Обследование и наблюдение новорожденных по программе массового скрининга должно проводиться с соблюдением принципов профилактики перекрестного и внутрибольничного инфицирования, оптимально амбулаторно или в условиях дневного стационара [2].

Таблица 8. Этапы неонатального скрининга в Российской Федерации (Приказ N 185 от 22.03.2006 "О массовом обследовании новорожденных детей на наследственные заболевания").

- Для диагностики муковисцидоза рекомендуется проведение потовой пробы (исследование уровня хлоридов в поте, комплекс исследований для диагностики муковисцидоза). Для установления диагноза необходимо получить как минимум 2 положительных результата. Потовая проба может быть проведена ребенку в возрасте 48 часов с весом не менее 2 кг [1, 2, 15, 47].

(УУР - C, УДД - 5).

Комментарии: Потовая проба является "золотым стандартом" диагностики муковисцидоза, проводится как минимум дважды. В РФ используются 2 методики потового теста.

1) Классический прямой метод определения электролитного состава пота (хлора или натрия) методом пилокарпинового электрофореза по Гибсону и Куку (1959 г.). Норма - до 30 ммоль/л, пограничные значения 30 - 59 ммоль/л, положительный результат - 60 ммоль/л и выше (при навеске пота не менее 100 мг) [1,2,4,31,]. Показатели хлоридов выше 150 ммоль/л должны быть подвергнуты сомнению.

2) Потовая проба путем определения проводимости пота с помощью специальных потовых анализаторов коррелирует с определением уровня хлоридов, позволяет получить адекватный результат при количестве пота в образце - 3 - 10 мкл. Получил широкое распространение при внедрении массового скрининга новорожденных.

При определении проводимости положительным результатом для муковисцидоза считается показатель: выше 80 ммоль/л; пограничным значением - 50 - 80 ммоль/л; нормальным - до 50 ммоль/л. Показатели проводимости выше 170 ммоль/л должны быть подвергнуты сомнению.

Время сбора пота не должно превышать 30 минут, минимально допустимое количество пота - 75 - 100 мг (15 мкл в коллекторе "Macroduct"), скорость потоотделения должна быть не менее 1 г/м²/мин [15]. Обязательным является предварительное тщательное очищение кожи пациента [2]. Особого внимания требует подготовка кожи у пациентов, длительно находящихся в стационаре.

Пограничные результаты потовой пробы.

Возможные причины пограничных результатов потовой пробы:

- Индивидуальные особенности у людей без муковисцидоза, особенно у взрослых

- Неправильная подготовка к пробе

- Носительство "мягких" мутаций при муковисцидозе [15]

Рекомендации:

- использование разных методов определения хлоридов пота, повторные исследования;

- расширенный ДНК-анализ (секвенирование гена);

- расширенное клинико-лабораторное и инструментальное обследование: копрология и фекальная эластаза, электролиты в биохимическом анализе крови, посев мокроты/мазок с задней стенки глотки, рентгенография грудной клетки, пазух носа, спермограмма;

- наблюдение в центре муковисцидоза до окончательного принятия решения о диагнозе. Не снимаются с учета, пока диагноз не будет исключен;

- метод определения разности назальных потенциалов или измерение электрического тока в биоптате кишки, отражающие нарушение функции хлорного канала <*>.

--------------------------------

Примечание: <*> В качестве дополнительного теста пациентам с подозрением на муковисцидоз, особенно в сомнительных случаях при пограничных значениях потового теста, при невыраженной симптоматике и/или при неполных классических проявлениях болезни может быть рекомендовано проведение исследования разности кишечных потенциалов [1, 2, 4, 31, 48].

Согласно стандартным операционным процедурам, для измерения разности кишечных потенциалов используются ректальные биоптаты, полученные при ректороманоскопии. Для проведения исследования необходимо не менее 4 образцов биоптатов. Рекомендуемые референтные значения (контрольные показатели здоровых людей) при использовании метода ОРКП в РФ: плотность тока короткого замыкания () в ответ на введение амилорида (стимуляция натриевых каналов) в контрольной группе составила 8.98 3.42 . Изменение в ответ на введение форсколина (стимуляция хлорных каналов) составило 25.78 4.41 . В ответ на введение гистамина изменяется в положительную сторону, что отражает вход ионов калия в клетки. При этом плотность тока составила 101.68 10.99 [49].

- Рекомендовано проведение молекулярно-генетического исследования для идентификации мутаций гена МВТР (CFTR) (молекулярно-генетическое исследование мутаций в гене CFTR (муковисцидоз) в крови, комплекс исследований для диагностики муковисцидоза) по показаниям:

1. Новорожденным с положительным ИРТ и положительными или пограничными значениями потовой пробы, мекониевым илеусом

2. Людям с пограничными значениями потовой пробы (см. Раздел "Диагностика муковисцидоза")

3. Пациентам с клиническими проявлениями классического или моносимптомного МВ

4. При CFTR-ассоциированных заболеваниях (панкреатит, врожденное двустороннее отсутствие семявыносящего протока/обструктивная азооспермия)

5. Родственникам пациентов с МВ (для определения статуса носительства по желанию)

6. Женщинам после рождения первого ребенка с муковисцидозом, а также во время последующих беременностей при наличии ребенка с муковисцидозом

7. Плод на 10 - 12-й неделе при подозрении на МВ (при наличии сибса с МВ) или обнаружении гиперэхогенного кишечника при УЗ-обследовании

8. Донорам гамет и эмбрионов в программах ЭКО (ЭКО-ИКСИ), внутриматочной инсеминации

9. Супружеским парам с высоким генетическим риском МВ, желающим пройти ЭКО-ПГТ МВ для предотвращения рождения ребенка с МВ (при отсутствии противопоказаний и ограничений) [2, 15, 50].

(УУР - C, УДД - 5).

Комментарии: Клиническую значимость обнаруженных генетических вариантов следует устанавливать с учетом рекомендаций Консенсуса [2], постоянно обновляемых баз данных: [51].

Стратегия молекулярно-генетической диагностики МВ включает несколько этапов.

На первом этапе проводится поиск вариантов, наиболее частых в популяции, к которой принадлежит обследуемый [2].

На втором этапе проводят расширенный поиск более редких вариантов, используя секвенирование по Сэнгеру или высокопроизводительное секвенирование генома (MPS/NGS).

Третий этап. Обычными сканирующими методами, в том числе секвенированием, можно выявить нарушения последовательности гена, незначительные по протяженности: нуклеотидные замены, небольшие делеции/инсерции. Перестройки, охватывающие несколько экзонов/интронов, такими методами не выявляются. Рекомендуется использовать следующие технологии: MLPA - мультиплексную лигазную зондовую амплификацию либо QFMP - количественную флуоресцентную мультиплексную ПЦР [15, 23, 52].

Требования к лаборатории, проводящей анализы на патогенные варианты гена CFTR, изложены в Консенсусе [2].

Согласно данным Европейского консенсуса по МВ, проведение расширенного молекулярного исследования гена CFTR позволяет выявить патогенный вариант в 98%. Это может быть связано либо с тем, что использованные методы не позволили проанализировать регионы гена, где располагаются патогенные генетические варианты, либо с явлением однородительской дисомии, либо с фенокопиями МВ [15].