Таблица N 1. Критерии эффективности методики идентификации ГММ

N

Характеристика

Описание характеристики

Критерий

Методы оценки критерия

1

Специфичность ПЦР

Способность ПЦР-тест-системы выявлять только целевую ДНК.

ПЦР-тест-система должна выявлять целевую ДНК. ПЦР-тест-система не должна давать ложноположительных результатов, в том числе выявлять ДНК близкородственных и неродственных биологических видов в 100% проводимых исследований.

Для оценки специфичности используются контрольные панели образцов. В состав панели должны входить образцы, содержащие целевую ДНК и не содержащие целевую ДНК.

2

Чувствительность ПЦР

Наименьшее содержание копий целевой ДНК, которое может быть определено с использованием ПЦР-методики, в зависимости от свойств используемых праймеров и зондов

Чувствительность должна быть не ниже 100 копий целевой плазмидной ДНК в одной ПЦР

Проводятся исследования ряда десятикратных разведений целевой плазмидной ДНК с известной концентрацией в двух повторах каждое. Определяется максимальное разведение, при котором ДНК воспроизводимо выявляется (в двух повторах)

3

Эффективность ПЦР

Прирост матрицы на каждом цикле амплификации.

Эффективность ПЦР должна быть не ниже 90%.

Это соответствует значению наклона линейной области зависимости Ct от логарифма концентрации ДНК матрицы (slope): не ниже - 3,6 (приемлем диапазон slope 3,1 - 3,6)

Для оценки эффективности ПЦР проводится амплификация с рядом десятикратных разведений целевой плазмидной ДНК (пункт 2 настоящей таблицы) в двух повторах каждое. По результатам амплификации строится график зависимости Ct от логарифма концентрации ДНК матрицы. Определяется наклон линейной области (slope). Эффективность ПЦР оценивается по уравнению: E = [10 (-1 / slope)] - 1, в идеальном случае - при удвоении количества ПЦР продукта за один цикл: E = 100%, (slope = -3,32)

4

Предел обнаружения ПЦР-тест-системы (LOD)

Минимальное количество биологического искомого объекта в исследуемом образце, которое может достоверно обнаружить данный метод

Чем меньше искомого биологического объекта способен выявить метод, тем выше его чувствительность. Предел обнаружения ПЦР-тест-системы (LOD) должен составлять не более 0,1%

Готовится ряд модельных образцов с разным содержанием целевой матрицы. Готовятся образцы целевого ГММ ингредиента (от 5 до 0,001% содержания) в соответствующей матрице. Приготовленная панель исследуется с использованием ПЦР-методики. Определяется минимальное содержание ГММ-ингредиента в тотальной ДНК организма, при котором ГММ воспроизводимо выявляется (в десяти повторах)

5

Предел количественного определения (LOQ)

Наименьшее количество (концентрация) вещества в образце, которое может быть количественно оценено с использованием методики с требуемой правильностью и внутрилабораторной прецизионностью

Предел количественного определения (LOQ) должен быть не более 0,1%.

На пределе чувствительности относительное стандартное отклонение (RSD) не должно превышать 20%. Истинное значение измеряемой величины должно входить в полученный при измерениях доверительный интервал

Исследуются 10 повторов 0,1% ГММ-стандарта по ПЦР-методике. Рассчитывается среднее значение содержания ГММ в образце и относительное стандартное отклонение (RSD). Рассчитанное стандартное отклонение (RSD) сравнивается с критерием 20%. Также оценивается, входит ли истинное значение в доверительный интервал полученного среднего значения

6

Аналитическая область

Интервал определяемых аналитических характеристик, в котором получаемые результаты имеют приемлемый уровень правильности и прецизионности, приемлем диапазон 0,1 - 5%

Диапазон 0,1 - 5% ГММ экспериментальных данных должен удовлетворять линейной модели (пункт 7 настоящей таблицы)

Проводятся исследования образцов с различным содержанием ГММ. Оценивается линейность зависимости аналитического сигнала

7

Линейность

Наличие линейной зависимости аналитического сигнала в анализируемой пробе в пределах аналитической области методики. Оценивается как коэффициент корреляции R2, определяющий верность модели линейной зависимости Ct от логарифма концентрации калибровочных образцов

Коэффициент R2 для калибровочных образцов должен быть не менее 0,98%

Исследуются в двух повторах 0,1%, 1,0% и 5% калибровочные ГММ-стандарты по ПЦР-методике. Строится калибровочная прямая (dCt от lgC), оценивается коэффициент корреляции данных с линейной зависимостью (R2)

8

Правильность

Отклонение среднего результата определений, выполненных с использованием методики, от значения, принимаемого за истинное

Методика дает корректные результаты, если значения, принимаемые за истинные, лежат внутри доверительных интервалов соответствующих средних результатов анализов, полученных экспериментально по данной методике

Готовятся образцы из калибровочных ГММ-стандартов 0,1%, 1,0% и 5% с добавлением матриц различного происхождения путем смешивания указанных стандартов с другими ингредиентами (сухим молоком, мясным фаршем, рыбной мукой). Образцы исследуются по ПЦР-методике в двух повторах. Оценивается, входит ли истинное значение в диапазон погрешности полученного среднего значения для каждого образца