Таблица N 3. Критерии эффективности методики идентификации ГМО

N п/п

Характеристика

Описание характеристики

Критерий

Методы оценки критерия

1

Специфичность ПЦР

Способность ПЦР тест-системы выявлять только целевую ДНК

ПЦР тест-система должна выявлять целевую ДНК.

ПЦР тест-система не должна давать ложноположительных результатов, в том числе выявлять ДНК близкородственных и неродственных биологических видов, в 100% проводимых исследований

Для оценки специфичности используют контрольные панели образцов. В состав панели входят образцы, содержащие целевую ДНК и не содержащие целевую ДНК

2

Чувствительность ПЦР

Наименьшее содержание копий целевой ДНК, которое может быть определено с использованием данной ПЦР методики, в первую очередь, зависит от свойств используемых праймеров и зондов

Чувствительность должна быть не ниже 100 копий целевой ДНК, например, плазмидной, в одной ПЦР реакции

Проводят исследования ряда десятикратных разведений целевой плазмидной ДНК с известной концентрацией в двух повторах каждое. Определяют максимальное разведение, при котором ДНК воспроизводимо выявляется (в двух повторах)

3

Эффективность ПЦР

Характеризует прирост матрицы на каждом цикле амплификации

Эффективность ПЦР должна быть не ниже 90%.

Это соответствует значению наклона линейной области зависимости Ct от логарифма концентрации ДНК матрицы (slope): не ниже - 3,6 (приемлем диапазон slope 3,1 - 3,6)

Для оценки эффективности ПЦР проводят амплификацию с рядом десятикратных разведений целевой плазмидной ДНК (пункт 2 настоящей таблицы) в двух повторах каждое.

По результатам амплификации строят график зависимости Ct от логарифма концентрации ДНК матрицы. Определяют наклон линейной области (slope). Эффективность ПЦР оценивают по уравнению:

E = [10 (- 1 / slope)] - 1, в идеальном случае - при удвоении количества ПЦР продукта за один цикл: E = 100%, (slope = -3,32)

4

Предел обнаружения ПЦР-тест системы (LOD)

Отражает минимальное количество биологического искомого объекта в исследуемом образце, которое может достоверно обнаружить данный метод

Чем меньше искомого биологического объекта способен выявить метод, тем выше его чувствительность. Определяется экспериментально, но должен составлять не более 0,1%

Готовят ряд модельных образцов с разным содержанием целевой матрицы. Готовят образцы целевого ГМО ингредиента (от 5% до 0,001% содержания) в соответствующей матрице. Исследуют приготовленную панель с использованием ПЦР методики. Определяют минимальное содержание ГМО ингредиента в тотальной ДНК организма, при котором ГМО воспроизводимо выявляется (в десяти повторах)

5

Предел количественного определения (LOQ, quantitation limit)

Наименьшее количество (концентрация) вещества в образце, которое может быть количественно оценено с использованием методики с требуемой правильностью и внутрилабораторной прецизионностью

Предел должен быть не более 0,1%.

На пределе чувствительности относительное стандартное отклонение (RSD) не должно превышать 20%.

Истинное значение измеряемой величины должно входить в полученный при измерениях доверительный интервал

Исследуют 10 повторов 0,1% ГМО стандарта по ПЦР методике. Рассчитывают среднее значение содержания ГМО в образце и относительное стандартное отклонение (RSD). Сравнивают рассчитанное стандартное отклонение (RSD) с критерием 20%. Также оценивают, входит ли истинное значение в доверительный интервал полученного среднего значения

6

Аналитическая область (dynamic range)

Интервал определяемых аналитических характеристик, в котором получаемые результаты имеют приемлемый уровень правильности и прецизионности, приемлем диапазон 0,1% - 5%

Диапазон 0,1% - 5% ГМО экспериментальных данных, должен удовлетворять линейной модели (пункт 7 настоящей таблицы)

Проводят исследования образцов с различным содержанием ГМО. Оценивают линейность зависимости аналитического сигнала

7

Линейность

Наличие линейной зависимости аналитического сигнала в анализируемой пробе в пределах аналитической области методики. Оценивается как R2 коэффициент корреляции, определяющий верность модели линейной зависимости Ct от логарифма концентрации калибровочных образцов

R2 коэффициент для калибровочных образцов должен быть не менее 0,98%

Исследуют в двух повторах 0,1%, 1,0% и 5% калибровочные ГМО стандарты по ПЦР методике. Строят калибровочную прямую (dCt от lgC), оценивают коэффициент корреляции данных с линейной зависимостью (R2)

8

Правильность

Правильность методики характеризуется отклонением среднего результата определений, выполненных с ее использованием, от значения, принимаемого за истинное

Методика дает корректные результаты, если значения, принимаемые за истинные, лежат внутри доверительных интервалов соответствующих средних результатов анализов, полученных экспериментально по данной методике

Готовят образцы из калибровочных стандартов 0,1%, 1,0% и 5% с добавлением матриц различного происхождения (для этого смешивают стандарты с другими ингредиентами, сухим молоком, мясным фаршем, рыбной мукой). Исследуют образцы по ПЦР методике в двух повторах. Оценивают, входит ли истинное значение в диапазон погрешности полученного среднего значения для каждого образца