1.5. Учет и анализ результатов

Основным критерием токсичности действия веществ на тест-объект следует считать изменение численности клеток водорослей, последовательность прохождения ими всех стадий развития и их способности к размножению.

Для подсчета численности клеток используют счетную камеру Горяева или счетную камеру Фукса-Розенталя.

При работе с камерой Горяева камеру и покровное стекло обезжиривают (промывают спиртом). Затем из колбы наносят пипеткой по капле суспензии водорослей на верхнюю и нижнюю сетки счетной камеры, накрывают камеру покровным стеклом, которое притирают по бокам до появления колец интерференции. Через 1 - 2 мин. начинают подсчет водорослей в 5 больших квадратах камеры, расположенных по диагонали сетки счетной камеры, или в 25 больших квадратах всей камеры при малой плотности водорослей. Под микроскопом просчет из каждой контрольной и опытной колбы проводят не менее трех раз.

По окончании эксперимента рассчитывают численность клеток водорослей в остром и хроническом опытах по сравнению с контролем (в том числе и в процентах).

Учет численности клеток можно также проводить в камере Фукса-Розенталя объемом 3,2 мл. При высокой численности клеток просчитывают по диагонали 16 квадратов, при малой - считают по всему полю камеры. Количество клеток также выражают в 1 см3. Расчет клеток производят по формуле:

где М - количество клеток в 1 см3; m - количество просчитанных клеток (сумма); n - количество просчитанных маленьких квадратов камеры; V - объем части камеры, имеющей площадь маленького квадрата.

Результаты исследования учитывают, если численность клеток водорослей в контроле увеличивается за 96 ч не менее чем в 3 раза. При изменении численности клеток в контроле менее чем в 3 раза результаты опыта считаются недействительными.

Используя приемы статистической обработки, устанавливают достоверность различия (снижение или увеличение) численности клеток между опытом и контролем.

Численность живых и мертвых клеток определяют с помощью люминесцентной микроскопии. Ранжируя клетки по интенсивности свечения, можно установить время воздействия вещества на водоросли, степень и скорость отмирания.

На практике в основном различают три цвета - жизнеспособные клетки светятся ярким пурпурно-красным светом, отмирающие - различными оттенками тускло-красного или оранжево-красного тона, мертвые - желтовато-салатным. При подсчете клеток водорослей учитываются все три группы - живые, мертвые и отмирающие клетки. В стадии интенсивного роста клеток водорослей в культуре наблюдается минимальное присутствие мертвых клеток.

Помимо люминесцентной микроскопии разделение живых и мертвых клеток может проводиться путем микроскопии в видимой области с использованием специальных красителей.

Активная реакция среды - изменение pH среды служит интегральным косвенным показателем состояния культуры. Чем выше жизнеспособность водорослей, тем значительнее изменяется на свету реакция среды (подщелачивание) в результате фотосинтетической ассимиляции углекислоты. Измерение pH среды осуществляется с помощью pH-метра, что является обязательным в начале и конце опыта, при хроническом эксперименте - в дни учета биологических показателей.