VII. ПЦР с детекцией результатов методом ферментного анализа на биологическом микрочипе

VII. ПЦР С ДЕТЕКЦИЕЙ РЕЗУЛЬТАТОВ МЕТОДОМ ФЕРМЕНТНОГО

АНАЛИЗА НА БИОЛОГИЧЕСКОМ МИКРОЧИПЕ

7.1. Используются следующие праймеры:

- на 35S-промотор вируса мозаики цветной капусты:

5' CGG CTA CTC CAA GAA TAT CAA AGA TAC AGT TTC AGA AGA (39 н.о.),

5' CCA TTT TCC TTT TTT ATT GTC CTT TCG ATG AAG TGA CAG A (40 н.о.);

- на маркерный ген gus из бактерии Escherichia coli:

5' ACC GTA CCT CGC ATT ACC CTT ACG CTG AAG AGA (33 н.о.),

5' TGC CCG CTT CGA AAC CAA TGC CTA AAG AGA (30 н.о.);

- на терминатор nos из агробактерии Agrobacterium tumefaciens:

5' GGA CAA GCC GTT TTA CGT TTG GAA CTG ACA GA (32 н.о.),

5' GCC TGA CGT ATG TGC TTA GCT CAT TAA ACT CCA GA (35 н.о.);

- на маркерный ген nptII из транспазона Tn5 бактериального происхождения:

5' GTG ACC CAT GGC GAT GCC TGC TTG C (25 н.о.),

5' ACC CAG CCG GCC ACA GTC GAT GAA TCC AGA (30 н.о.):

- на промотор ocs из агробактерии Agrobacterium tumefaciens:

5' AAA AAG TGG CAG AAC CGG TCA AAC CTA AAA GA (32 н.о.),

5' CGT TAT TAG TTC GCC GCT CGG TGT GTC GTA GA (32 н.о.).

7.2. Набор реактивов для асимметричной мультиплексной ПЦР (амПЦР) включает:

- сухие смеси, включающие Taq ДНК полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфаты, хлорид магния с конечными концентрациями, соответственно, 1 ед. 200 мкМ и 2,5 млМ, оптимизированную буферную систему для проведения одной стандартной ПЦР:

- растворитель;

- минеральное масло;

- "+" контроль амплификации - 1 пробирка, 0,5 мл.

7.3. Проведение реакции:

- необходимое количество микропробирок с сухими реактивами промаркировать соответствующим образом: "-" контроль", "исследуемые пробы", "+" контроль";

- добавить во все пробирки по 5 мкл праймеров, 10 мкл растворителя;

- в пробирку, которая служит отрицательным контролем, добавить 5 мкл деионизированной воды, в опытные пробирки - по 5 мкл раствора исследуемой ДНК, в пробирку с положительным контролем - 5 мкл раствора контрольной ДНК;

- добавить во все пробирки по 20 мкл минерального масла;

- пробы готовы для проведения амплификации;

- запустить программу амплификации:

- после проведения амплификации пробы готовы для осуществления гибридизации.

7.4. Гибридизация ДНК, ферментный анализ на биологическом микрочипе и сканирование результатов:

- набор реактивов для ДНК гибридизации и ферментного анализа содержит 20 x SSC - 50 мл, диаминобензидин (ДАБ) - 100 таблеток, конъюгат пероксидазы хрена со стрептавидином - 0,1 мл с концентрацией 1 мг/мл, 1 пробирка;

- приготовить рабочие разведения раствора 20 x SSC (3 М NaCl, 0,3 М цитрат натрия, pH 7,4): 2 x SSC, 0,1% SDS; 0,1 x SSC; 0,1 x SSC, 0,1% SDS; 0,01 x SSC;

- схема приготовления 100 мл раствора:

- микропробирки с продуктами амплификации ДНК центрифугировать 1 - 2 секунды для сбора пробы на дне пробирки, добавить в каждую микропробирку 5 мкл 20 x SSC и 0,2 мкл 10% SDS, перемешать, центрифугировать 1 - 2 секунды при 3000 об/мин, распределить полученную смесь по поверхности микрочипа, содержащей зоны иммобилизованных олигонуклеотидов;

- поместить микрочип во влажную камеру, поставить на 1 час в воздушный термостат с температурой 42 °C;

- по окончании реакции капли смыть буфером 2 x SSC, 0,1% SDS, тщательно промыть чип растворами 2 x SSC, 0,1% SDS - 1 раз 5 минут, 0,1 x SSC, 0,1% SDS - 2 раза по 5 минут, 0,1 x SSC - 5 раз по 1 минуте, 0,01 x SSC - в течение 10 секунд.

7.5. Проведение ферментного анализа:

- исходный стрептавидин-пероксидазный конъюгат разбавить в 200 раз буфером 1 x SSC, содержащим 1% БСА (бычий сывороточный альбумин), из расчета 25 мкл на микрочип;

- нанести 25 - 30 мкл разведенного конъюгата на рабочую зону микрочипа и поместить его на 30 минут во влажную камеру при комнатной температуре;

- смыть конъюгат раствором 1 x SSC;

- залить микрочип раствором 2 x SSC, промыть 5 минут;

- промыть микрочип раствором 1 x SSC;

- непосредственно перед применением приготовить раствор субстрата - диаминобензидина (ДАБ), для этого растворить таблетку ДАБ в 1 см3 буфера 0,1 x SSC, добавить 30 мм3 3%-ного раствора пероксида водорода и перемешать, раствор использовать немедленно;

- залить рабочую зону микрочипа раствором субстрата, выдержать от 2 до 10 минут при комнатной температуре;

- в случае положительной реакции появляются коричневые пятна окисленного субстрата;

- промыть микрочип дистиллированной водой, встряхнуть капли воды и поместить в термостат 42 °C на 5 - 10 минут, после сушки микрочип с окрашенными зонами хранить в темном месте.

7.6. Сканирование биологических микрочипов:

- осуществлять с применением аппаратно-программного комплекса для анализа биологических микрочипов типа "ДЕГМИГЕН-001" и компьютерной программы для анализа изображений;

- в соответствии с руководством по эксплуатации, поставляемым в комплекте с аппаратно-программным комплексом, подготовить сканер микрочипов к работе;

- поместить микрочип в рамку для сканирования, зафиксировать его и закрыть рамку;

- запустить программу сканирования, функционирующую в диалоговом режиме, дождаться появления на мониторе приглашения к сканированию и только после этого вставить рамку с микрочипом в приемное окно детектора;

- после завершения сканирования микрочипа сохранить изображение, присвоив файлу соответствующее имя.

7.7. Анализ изображений биочипов:

- запустить программу обработки изображения микрочипа, ввести оцифрованное изображение в программу, для этого выбрать опцию "Файл", открыть изображение, в появившемся диалоговом окне выбрать формат, в котором представлены изображения, и выбрать в списке нужный файл, изображение появится в основном окне программы;

- провести операцию разметки матрицы, чтобы совместить центры измерительных зондов с центрами пятен решетки в изображении, для этого выбрать опцию "Анализ", "Разметка матрицы";

- разметка начинается с рисования прямоугольника, боковые стороны которого проходят через центры узлов крайних столбцов, для этого нужно щелкнуть левой кнопкой мыши в центре левого верхнего пятна/ячейки, затем, держа кнопку нажатой, переместить правую нижнюю вершину появившегося прямоугольника в центр нижнего правого узла;

- в результате предварительной разметки на экране появится четырехугольник с внутренними линиями, расположенными равномерно, в соответствии с заданным числом столбцов матрицы, чтобы завершить разметку и закрыть диалоговое окно, нужно нажать клавишу "Принять";

- после завершения базовой разметки провести автоматическую коррекцию положения зондов, для этого в меню выбрать опцию "Настройки/Автоматическая подстройка";

- для анализа результатов нужно выбрать опцию меню "Анализ" - "Показать результаты", по окончании измерений программа предоставляет возможность подготовки и распечатки протокола испытаний, для этого нужно выбрать опцию меню "Файл" и затем "Заполнить протокол", после этого появится окно с формой для заполнения, после того как она будет заполнена, нажать кнопку "Выход".

7.8. Интерпретация результатов:

- появление регистрируемого компьютерной программой оптического сигнала в одной, нескольких или во всех пяти зонах гибридизации, содержащих иммобилизованные олигонуклеотиды, указывает на присутствие рекомбинантной ДНК, свидетельствующей о наличии ГМО растительного происхождения в анализируемом образце;

- отсутствие регистрируемого оптического сигнала во всех пяти гибридизационных зонах, содержащих иммобилизованные олигонуклеотиды, указывает на отсутствие рекомбинантной ДНК, что свидетельствует о том, что анализируемый образец не имеет ГМО растительного происхождения;

- появление оптического сигнала в зоне гибридизации при использовании отрицательного контроля амплификации свидетельствует о получении ложноположительного результата, причиной может быть загрязнение реактивов и/или оборудования, в этом случае необходимо обработать поверхности лабораторных столов и оборудования раствором 1H соляной кислоты, заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить анализ;

- отсутствие оптического сигнала при использовании положительного контроля амплификации свидетельствует о получении ложноотрицательного результата, причиной могут быть потеря активности одного из компонентов реакционной смеси для амПЦР и/или гибридизации с применением ферментного анализа на биологическом микрочипе, в этом случае необходимо заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить анализ.