Проведение амплификации с детекцией в режиме "реального времени"

3.96. Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, включая объем пробы ДНК - 2 мкл. Выбор пробирок для амплификации зависит от используемого амплификатора с системой детекции в режиме "реального времени". Для внесения в пробирки реагентов, проб ДНК и контрольных образцов используются одноразовые наконечники с фильтрами.

3.97. Для постановки ПЦР можно использовать готовые наборы, например, "2,5 x Реакционная смесь для проведения ПЦР-РВ".

3.97.1. Подготавливают реакционную смесь. Для тестирования даже одного исследуемого образца проводят постановку контролей. Кроме того, берут реагенты с запасом: для тестирования N образцов готовят реагенты для (N + 1) реакций. В отдельной пробирке смешивают из расчета на каждый образец: 2.5 * Реакционной смеси 10 мкл; MgCI₂ 25 мМ 1,5 мкл; ddH₂O 5,28 мкл; праймеры в концентрации 20 пмколь/мкл по 0,415 мкл каждого; ДНК-зонды в концентрации 10 пмколь/мкл по 0,415 мкл каждого.

3.97.2. Вносят в каждую пробирку по 23 мкл подготовленной реакционной смеси. В пробирки с реакционной смесью добавляют по 2 мкл проб ДНК, полученных в результате экстракции из исследуемых или контрольных образцов.

3.98. Проведение амплификации с детекцией в режиме "реального времени". Программируют прибор (амплификатор с системой детекции в режиме реального времени) для выполнения соответствующей программы амплификации и детекции флуоресцентного сигнала согласно инструкции данного прибора. При использовании указанных праймеров возможно применение программы амплификации: плюс 95 °C 5 минут - 1 цикл; плюс 94 °C 30 секунд и плюс 56 °C 90 секунд - 40 циклов. Устанавливают пробирки в ячейки реакционного модуля прибора. Запускают выполнение программы амплификации с детекцией флуоресцентного сигнала. По окончании выполнения программы приступить к анализу и учету результатов.