XI. Получение и характеризация хорьковой штаммоспецифичной референс-сыворотки для исследования антигенных свойств штаммов вируса гриппа в реакции торможения гемагглютинации

11.1. Общие положения.

В реакции торможения гемагглютинации в качестве референс-сывороток или контрольных положительных сывороток наиболее часто используют сыворотки крови хорьков, переболевших гриппом, поскольку хорек (Mustela putoris) является наиболее адекватной моделью для изучения вируса гриппа человека. Однако, перед работой необходимо подтвердить серонегативный статус в отношении гриппа, т.к. хорьки высоко восприимчивы к гриппу человека, особенно к развитию гриппозной пневмонии.

Принцип метода получения штаммоспецифичной референс-сыворотки от хорьков заключается в получении антисыворотки после однократного или двукратного интраназального инфицирования животного охарактеризованным по антигенным свойствам штаммом вируса гриппа. При этом достигается оптимальный титр (не менее 1:80) антивирусных антител в сыворотке крови.

Для получения штаммоспецифичной референс-сыворотки необходимо использовать хорьков в возрасте от 6 месяцев, в крови которых нет антител к вирусам гриппа человека.

Титр штаммоспецифичных противовирусных антител на всех этапах процедуры тестируют в реакции торможения гемагглютинации.

Все манипуляции с животными должны проводиться с соблюдением требований нормативных документов <26>.

--------------------------------

<26> Федеральный закон от 27.12.2018 N 498-ФЗ "Об ответственном обращении с животными и о внесении изменений в отдельные законодательные акты Российской Федерации" (далее - Федеральный закон от 27.12.2018 N 498-ФЗ); Директива Европейского парламента и Совета Европейского Союза 2010/63/EC от 22.09.2010 о защите животных, использующихся для научных целей.

11.2. Скрининг животных.

За 3 дня до инфицирования у каждого подопытного животного берут пробу крови (нулевая сыворотка) для тестирования в РТГА (Раздел IX), чтобы оценить отсутствие в сыворотке антител к актуальным вирусам гриппа A и B, циркулирующим в человеческой популяции: штамм, которым будет впоследствии инфицирован хорек (целевой антиген), контрольные штаммы - A/H1N1 pdm09, A/H3N2, B/Victoria, B/Yamagata.

В эксперимент отбирают только серонегативные животные с титром антител против целевого и контрольных вирусов < 1:20. При титре антител 1:20 животное нельзя использовать для получения штаммоспецифичной референс-сыворотки.

11.3. Методика забора крови животных.

Работы с инфицированными животными проводятся в виварном блоке 2 или 3 уровня биологической безопасности.

Подготавливаются пробирки для крови и маркируются номером животного.

В БМБ 2 класса проводится наркотизация хорька (пункт 12.6).

По наступлению наркотизации (мышцы расслаблены, отсутствие рефлексов, роговичный рефлекс отсутствует) придать животному положение - лежа.

Место укола при необходимости выстригают (забривание).

Дезинфекция кожи при помощи антисептических растворов (например, 70% раствор этилового спирта).

Процедура проводится с помощью одноразовых трехкомпонентных шприцев с иглой (19 - 23G) в зависимости от метода (сердечная пункция или забор из кровеносных сосудов).

При сердечной пункции:

Пальпацией определяют положение сердца путем выявления верхушечного толчка. Местом пункции служит второе межреберье слева на 1 - 1,5 см выше конца мечевидного отростка. От левого края грудины отступают на 2 мм и вертикальным уколом прокалывают грудную клетку. При верном попадании кровь начинает поступать в канюлю иглы. Если в шприц поступают пузырьки воздуха или серозной жидкости, это указывает, что игла находится в легких. В таких случаях иглу нужно вытянуть несколько назад. Затем медленно отбирают кровь.

Забор из кровеносных сосудов:

Накладывают жгут. Визуализация вены. Прокол и постепенное продвижение иглы вдоль сосуда. При верном попадании кровь начинает поступать в канюлю иглы. Ослабляют жгут и медленно отбирают кровь. Перенос крови в пробирку.

После проведения забора крови необходимо провести мероприятия по остановке кровотечения и дезинфекцию кожи ватным тампоном, смоченным антисептическим раствором, а после сухим ватным тампоном.

Проверяется общее состояние, наличие ровного дыхания и сердцебиения животного.

После забора крови животное помещают в клетку.

11.4. Приготовление сыворотки крови хорька.

Полученную от хорька кровь следует оставить на один час при комнатной температуре для ускорения свертывания, после чего образовавшийся сгусток отделить от стенок пробирки стеклянной палочкой/наконечником и поместить на 18 - 20 часов в холодильник при температуре плюс 4 - 8 °C. Далее центрифугировать при 250 - 400 g в течение 10 минут. Получившуюся сыворотку перенести в чистую пробирку. Правильно приготовленная сыворотка должна быть прозрачной, бесцветной или желтого цвета, без следов гемолиза. Сыворотку, полученную после тотального сбора крови, дополнительно необходимо профильтровать через стерильные фильтр-насадки с размером пор 0,22 мкм. Сыворотки можно оставить на ночь при температуре плюс 4 - 8 °C. Если необходимо более долгое хранение, необходимо заморозить сыворотки при температуре минус 20 °C или ниже.

11.5. Подготовка рабочего раствора вирусной суспензии.

Для заражения одного хорька необходимо приготовить суспензию, содержащую дозу вируса 10⁶ ЭИД₅₀ в 500 мкл физиологического раствора <27>.

--------------------------------

<27> МУ 3.3.2.1758-03.

11.6. Подготовка наркотизирующего средства для животных.

Заражение вирусом и взятие крови проводят только после наркотизации животного, для этого используют смесь препаратов Золетил 100 и Ксила или другие зарегистрированные в Российской Федерации препараты, согласно инструкции производителя.

11.7. Техника инфицирования животных.

При работе с хорьками следует использовать краги для защиты рук. Перед инфицированием следует наркотизировать животное, придать ему положение лежа на спине с приподнятой головой. Используя автоматическую пипетку, вводят вирусный материал интраназально в объеме 500 мкл (по 250 мкл в каждый носовой ход).

Наблюдение за животными следует осуществлять ежедневно, оценивать активность, аппетит, употребление животным воды в течение 14 дней (при однократном заражении и 42 дней при двукратном заражении).

11.8. Отбор контрольной пробы крови.

Пробу крови у хорьков берут на 14 сутки после инфицирования в количестве, достаточном для проведения серологических исследований (0,5 - 2 мл). Сыворотку тестируют в реакции торможения гемагглютинации.

Если через 14 суток после заражения сыворотка хорька имеет титр антител к целевому штамму вируса гриппа 1:40, то проводят реинфицирование. Реинфицирование проводят на 21 сутки после первого заражения. Реинфицирующая доза должна быть больше инфицирующей в 10 - 100 раз.

В случае гибели животного до тотального сбора крови необходимо подтвердить, что гибель произошла именно от инфекции, вызванной заражаемым вирусом гриппа. Для этого забирают патологический материал от животного и передают на исследование (выявление РНК вируса гриппа в МАНК и (или) выделение вируса в культуре клеток MDCK). При положительном результате при повторном заражении здорового хорька следует уменьшить заражающую дозу вируса в 100 раз.

11.9. Техника тотального сбора крови у хорька.

Сбор крови хорька осуществляют на 21 сутки после последнего инфицирования путем пункции сердца с тотальным забором крови (30 - 70 мл). После этого проводят эвтаназию животного, согласно нормативным документам <28>.

--------------------------------

<28> Федеральный закон от 27.12.2018 N 498-ФЗ; Директива Европейского парламента и Совета Европейского Союза 2010/63/EC от 22.09.2010 о защите животных, использующихся для научных целей.

11.10. Тестирование штаммоспецифичной сыворотки.

Готовую штаммоспецифичную сыворотку тестируют в РТГА против целевого и контрольных штаммов вируса гриппа. В тестирование включают и нулевую сыворотку этого животного. Титры антител полученной штаммоспецифичной сыворотки в РТГА с контрольными штаммами вируса гриппа, антигенно отличными от целевого, не должны отличаться от титров нулевой сыворотки больше, чем в 2 раза.

Штаммоспецифичная референс-сыворотка готова к использованию, если титр антител против целевого вируса гриппа 1:80.