2.3.2. Специфическая лабораторная диагностика

Все мероприятия, связанные с попытками обнаружения токсина или самого возбудителя, должны проводиться специально подготовленным персоналом.

- Рекомендовано использовать кровь больного, кал, рвотные массы или промывные воды желудка, отделяемое из раны, кусочки отторгаемых тканей и мазки - отпечатки с поверхности раны (в случае раневого ботулизма) с целью лабораторной диагностики ботулизма [1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 26, 27, 33, 34, 35, 43, 44, 45, 47 - 56].

Уровень убедительности рекомендаций A (уровень достоверности доказательств - 1)

Комментарий: забор материала для лабораторных исследований осуществляется при первом подозрении на ботулизм до введения больному антитоксина ботулинического типа. Обычно для проведения всех лабораторных исследований оказывается достаточным 15 - 20 мл крови, взятой в стерильных условиях из любой вены пациента и 25 - 50 г каловых масс. Материал должен быть тщательно упакован, снабжен четкими надписями и отправлен на исследование в максимально короткий срок. Хранить забранный материал надо при низкой температуре, но не замораживать. Отделяемое из раны желательно сразу после сбора помещать в анаэробные условия.

- Рекомендовано проведение исследования сыворотки крови больного, промывных вод желудка, рвотных масс, испражнений больного на реакцию биологической нейтрализации токсина (ботулотоксинов антитоксином ботулиническим типа A**, антитоксином ботулиническим типа B**, антитоксином ботулиническим типа E**) на белых мышах всем пациентам с подозрением на ботулизм для обнаружения и идентификации токсина [1, 2, 3, 5 - 9, 12, 13, 26, 27, 34, 35, 43 - 45, 47 - 57].

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 5)

- Рекомендовано микробиологическое культуральное исследование промывных вод желудка, рвотных масс, испражнений больного, остатков подозрительного продукта с целью лабораторной диагностики ботулизма [1, 2, 3, 5 - 9, 12, 13, 26, 27, 34, 35, 43 - 45, 47 - 57].

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 5)

Комментарии: успех исследования в большей мере зависит от соблюдения описанных выше условий при сборе материала для анализов. Наличие в употреблявшейся пище возбудителя без токсина не является достаточным основанием для постановки диагноза. Все существующие в мире иные, кроме реакции биологической нейтрализации токсина на белых мышах, методы обнаружения и идентификации ботулинического токсина либо недостаточно специфичны, либо малочувствительны, либо чрезвычайно трудоемки, либо находятся в стадии разработки. В любом случае они требуют подтверждения биологической пробой и реакцией нейтрализации (РН) на мышах.

- Рекомендовано определение токсинов возбудителя ботулизма в промывных водах желудка, рвотных массах, испражнениях больного, остатках подозрительного продукта методами ИФА и иммуно-ПЦР с целью лабораторной диагностики ботулизма [1, 2, 3, 5 - 9, 12, 13, 26, 27, 34, 35, 43 - 45, 47 - 57].

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 5)

Комментарии: ИФА - для постановки реакции используют токсинспецифические поликлональные или моноклональные антитела к 8-ми серотипов нейротоксина.

Иммуно-ПЦР - группа сверхчувствительных методов, которые сочетают специфичность распознавания антигенов антителами и чувствительность ПЦР.

Латексная проба - метод, позволяющий для обнаружения ботулотоксина в исследуемом материале использовать цветные полистирольные или суперпарамагнитные латексные частицы, сенсибилизированные специфичными антителами против ботулотоксинов. Иммунохроматографический анализ (ИХА) - иммунохимический способ выявления ботулотоксинов, чувствительность 5 - 50 нг/мл.

Указанные методы могут считаться лишь вспомогательными, тогда как окончательные выводы зависят от результатов пробы на мышах [2].

- Рекомендовано постановка биохимических тестов из материала промывных вод желудка, рвотных масс, испражнений больного, остатков подозрительного продукта с целью лабораторной диагностики ботулизма [1, 2, 3, 5 - 9, 12, 13, 26, 27, 34, 35, 43 - 45, 47 - 57].

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 5)

Комментарии: Эндопептидазный тест: тест способен различать активные и инактивированные токсины) - основан на выявлении активности цинксодержащей протеазы ботулотоксина в отношении синтетических пептидов, имеющие те же сайты гидролиза, что и SNARE-белки (целевые белки для ботулотоксинов). После инкубации активный ботулотоксин ферментативно гидролизует синтетические пептиды с образованием пептидов различной молекулярной массы. Фрагменты, полученные в результате расщепления синтетических пептидов, специфичны для каждого типа токсина. Эту специфичность определяют с помощью масс-спектрометрии с лазерной времяпролетной десорбционной ионизацией MALDITOF-MS).

Метод масс-спектрометрия: в применении к идентификации белковых молекул является наиболее эффективным! по сравнению с другими биохимическими и физико-химическими методами. Он сочетает в себе высокую чувствительность на уровне метода иммуноферментного анализа (ИФА), но в отличие от ИФА метод масс-спектрометрии позволяет идентифицировать белки с более высокой степенью достоверности. А также одновременно определять большое количество различных белков, в то время как для определения белков методом ИФА для каждого из искомого белков необходимо иметь специфическое антитело. Время проведения 2 дня.

В любом случае указанные методы могут считаться лишь вспомогательными, тогда как окончательные выводы зависят от результатов пробы на мышах [2].

- Рекомендовано молекулярно-генетические методы исследования промывных вод желудка, рвотных масс, испражнений больного, остатков подозрительного продукта с целью лабораторной диагностики ботулизма. [1, 2, 3, 5 - 9, 12, 13, 26, 27, 34, 35, 43 - 45, 47 - 57].

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 5)

Комментарии: основаны на ПЦР - возможно выявление генов токсинообразования только при наличии C. botulinum в образце.