IV. Порядок работы

4.1. Работы с использованием метода ПЦР с использованием гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени проводятся в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <2> и методическими документами <3>.

--------------------------------

<2> СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней" (далее - СанПиН 3.3686-21), утвержденные постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации 28.01.2021 N 4 (зарегистрировано Минюстом 15.02.2021, регистрационный N 62500).

<3> МУ 1.3.2569-09 "Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I - IV групп патогенности", утвержденные Роспотребнадзором 22.12.2009.

4.2. В работе при выполнении метода ПЦР с использованием гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени используются образцы кДНК, полученные ранее на этапе экстракции и обратной транскрипции из биологического материала (мазки со слизистой оболочки носо- и ротоглотки, мокрота/аспираты из трахеи, бронхо-альвеолярная лаважная жидкость, секционный (аутопсийный) материал, культуры вирусов гриппа B), в которых была обнаружена РНК вируса B с помощью наборов реагентов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации в установленном порядке <4>.

--------------------------------

<4> Постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 1416 "Об утверждении Правил государственной регистрации медицинских изделий"; приказ Минздрава России от 06.06.2012 N 4н "Об утверждении номенклатурной классификации медицинских изделий" (зарегистрировано Минюстом России 09.07.2012, регистрационный номер 24852), с изменениями, внесенными приказами Минздрава России от 25.09.2014 N 557н (зарегистрировано Минюстом России 17.12.2014, регистрационный номер 35201), от 07.07.2020 N 686н (зарегистрировано Минюстом России 10.08.2020, регистрационный номер 59225).

4.3. Допускается хранение образцов кДНК до проведения ПЦР-исследования при температуре от плюс 2 °C до плюс 8 °C 3 суток, при температуре от минус 24 °C до минус 16 °C в течение года и однократное замораживание-оттаивание материала.

4.4. ПЦР-исследование состоит из следующих этапов:

- амплификация кДНК с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени;

- анализ и интерпретация результатов.=-

4.5. Выбор пробирок для амплификации зависит от используемого амплификатора с системой детекции в режиме реального времени и формы комплектации реагентов.

4.6. Для внесения в пробирки реагентов, проб кДНК и контрольных образцов используются одноразовые наконечники с фильтрами.

4.7. При подготовке к проведению реакции амплификации (общий объем реакционной смеси 25 мкл, включая объем пробы кДНК 10 мкл) с использованием пробирок с готовой ПЦР-смесью, залитой воском, выполняется следующая последовательность действий:

- отобрать необходимое количество пробирок с ПЦР-смесью, залитой воском, для амплификации кДНК исследуемых и контрольных образцов;

- убедиться, что воск полностью покрывает раствор на дне пробирок (если это не так, не использовать данные пробирки);

- на поверхность воска внести по 7 мкл смеси буфера с ферментом, при этом она не должна проваливаться под воск и смешиваться со смесью под воском;

- в подготовленные пробирки внести по 10 мкл проб кДНК, полученных в результате экстракции и обратной транскрипции из исследуемых образцов;

- в каждой постановке ПЦР использовать контрольные реакции этапа ПЦР: положительный контроль ПЦР (далее - К+) (в пробирку с реакционной смесью внести 10 мкл К+) и отрицательный контроль ПЦР (далее - К-) (в пробирку с реакционной смесью внести 10 мкл К-).

4.8. При подготовке к проведению реакции амплификации (общий объем реакционной смеси 25 мкл, включая объем пробы кДНК 10 мкл) с формой комплектации ПЦР-смеси, буфера и фермента ДНК-полимераза в отдельных пробирках выполняется следующая последовательность действий:

- рассчитать количество каждого реагента, требующееся для приготовления реакционной смеси (на одну реакцию требуется 10 мкл ПЦР-смеси, 5 мкл буфера и 0,5 мкл ДНК-полимеразы), учитывая, что смесь готовится на общее число исследуемых и контрольных образцов плюс запас на одну реакцию;

- реагенты для приготовления реакционной смеси следует смешивать непосредственно перед проведением ПЦР-исследования, предварительно разморозив, перемешав их содержимое и осадив капли на вортексе;

- в отдельной пробирке объемом 1,5 мл подготовить реакционную смесь, смешав необходимое количество ПЦР-смеси, буфера и ДНК-полимеразы, осадить капли на вортексе;

- отобрать необходимое количество пробирок или стрипов для амплификации кДНК исследуемых и контрольных проб;

- внести в каждую пробирку по 15 мкл приготовленной реакционной смеси, неиспользованные остатки реакционной смеси выбросить;

- в подготовленные пробирки внести по 10 мкл проб кДНК, полученных в результате экстракции и обратной транскрипции из исследуемых образцов;

- в каждой постановке ПЦР использовать контрольные реакции этапа ПЦР: положительный контроль ПЦР (К+) (в пробирку с реакционной смесью внести 10 мкл К+) и отрицательный контроль ПЦР (К-) (в пробирку с реакционной смесью внести 10 мкл К-).

4.9. Для проведения реакции амплификации на приборе необходимо:

- предварительно запрограммировать прибор (амплификатор с системой детекции в режиме реального времени) для выполнения амплификации и детекции флуоресцентного сигнала в соответствии с руководством пользователя прибора и инструкцией к используемому набору (комплекту) реагентов (приложение 2 к настоящим МР);

- установить пробирки в ячейки реакционного модуля прибора, при этом перед установкой в амплификатор планшетного типа необходимо осадить капли со стенок пробирок кратковременным (1 - 3 с) центрифугированием на центрифуге вортекс;

- запустить выполнение программы амплификации с детекцией флуоресцентного сигнала;

- по окончании выполнения программы приступить к анализу и интерпретации результатов.

4.10. Анализ результатов проводят с помощью программного обеспечения прибора, используемого для проведения ПЦР с детекцией в режиме реального времени, ориентируясь на инструкцию и (или вкладыш), прилагаемый к набору (комплекту) реагентов.

4.11. Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные результаты контрольных реакций амплификации кДНК в соответствии с инструкцией и (или) вкладышем, прилагаемым к набору реагентов для типирования (дифференциации линий Виктория и Ямагата) вирусов гриппа B в образцах кДНК, полученных из биологического материала, содержащего РНК вирусов гриппа B, методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации (приложение 3 к настоящим МР).

4.12. Результаты исследования считаются недостоверными в случаях, если:

- для положительного контроля ПЦР (К+) значение порогового цикла по любому из указанных каналов для флуорофоров отсутствует или превышает граничное значение, что требует повторения амплификации и детекции для всех образцов;

- для отрицательного контроля ПЦР (К-) определено значение порогового цикла, что происходит при контаминации лаборатории продуктами амплификации или контаминации реагентов и (или) исследуемых образцов на каком-либо этапе ПЦР-исследования. В этом случае требуется принятие мер по выявлению и ликвидации источника контаминации и повторение амплификации и детекции для всех образцов, в которых обнаружена специфическая кДНК;

- для исследуемого образца определено значение порогового цикла, при этом на графике флуоресценции отсутствует участок характерного экспоненциального подъема (график представляет собой приблизительно прямую линию), что требует проверки правильности выбранного уровня пороговой линии или параметров расчета базовой линии и повторного проведения амплификации и детекции для этого образца при правильном уровне пороговой линии (базовой линии).