IX. Определение уровня антител класса IgG

9.1. Наиболее доступным способом разделения антител классов IgM и IgG является разрушение макроглобулиновых антител (к которым относятся молекулы IgM) с помощью редуцентов. Под действием редуцирующих веществ IgM-антитела расщепляются с разрывом дисульфидных связей молекул белка, диссоциируя при этом на 6 - 8 мономеров, не обладающих активностью антител. Антитела класса IgG устойчивы к действию редуцентов и не разрушаются. Однако этот метод не позволяет оценить наличие IgM, если их количество в сыворотке меньше или равно антителам класса IgG.

9.2. В качестве редуцирующих веществ используют L-цистеин (солянокислый, или "свободный"), цистин, меркаптоэтанол, унитиол, этантиол, и др.

9.3. Для обработки сывороток 5%-й раствор унитиола (50 мг/мл) разводят в стерильной пробирке в 4 раза 0,9%-м раствором натрия хлорида до получения концентрации 1,25%, т.е. к 1 объему 5%-го раствора унитиола добавляют 3 объема 0,9%-го раствора натрия хлорида. Приготовленный таким образом 1,25%-й раствор унитиола можно хранить в холодильнике при плюс 4 °C в течение недели в пробирке с хорошо притертой воздухонепроницаемой пробкой.

Исследуемую инактивированную сыворотку разводят 1:5 в 0,9%-м растворе натрия хлорида и делят на 2 равные порции. К одной порции добавляют равный объем 1,25%-го раствора унитиола, к другой - равный объем 0,9%-го раствора натрия хлорида. Смешивание проводят в стерильных пробирках, которые плотно закрывают воздухонепроницаемыми пробками (или по типу "Эппендорф"). Обе порции сыворотки (обработанную редуцентом и необработанную) оставляют на 18 часов при комнатной температуре или на 2 часа в условиях термостата (плюс 37 °C), затем исследуют в РПГА с диагностикумами по вышеописанной методике, начиная с разведения 1:10.

9.4. Методика использования L-цистеина как редуцента приведена в методических указаниях <8>. В виду легкой окисляемости раствор готовят непосредственно перед применением и хранят не более 1 часа. Для этого 15,0 мг солянокислого L-цистеина или "свободного" цистеина растворяют в 1,0 мл 0,1 N раствора едкого натра (pH готового раствора 7,0 - 7,2).

--------------------------------

<8> МУ 4.2.2723-10.

Исследуемую инактивированную сыворотку разводят 1:5 в 0,9%-м растворе натрия хлорида и делят на 2 равные порции. К одной порции добавляют равный объем раствора цистеина, к другой - равный объем 0,9%-го раствора натрия хлорида. Смешивание проводят в стерильных пробирках, которые плотно закрывают воздухонепроницаемыми пробками (или по типу "Эппендорф"). Для уменьшения инактивации цистеина кислородом воздуха между содержимым пробирки и пробкой должно оставаться минимальное свободное пространство. Пробирки с обработанными и необработанными сыворотками выдерживают в течение 18 - 20 часов в термостате при плюс 37 °C. Затем обе пробы сыворотки исследуют в РПГА с диагностикумами по вышеописанной методике, начиная с разведения 1:10, при этом в раствор для титрования добавляют 1% нормальной инактивированной сыворотки крови (лошадиной, кроличьей, крупного рогатого скота), проверенной на отсутствие антител к применяемым диагностикумам.

9.5. Парные сыворотки всегда исследуются в одном опыте с одним диагностикумом: при определении суммарных антител и уточнении их класса.