Методы оценки действия БАД к пище на показатели перекисного окисления липидов

Методы оценки действия БАД к пище на показатели перекисного

окисления липидов

Мышам-самцам линии Balb/с вводят 0,25 мл 7%-ного масляного раствора CCl4 - одного из сильнейших стимуляторов ПОЛ, внутримышечно или алиментарно, через 15 - 20 мин. животным "per os" вводят исследуемую БАД к пище (5 животных в группе), 5-ти мышам контрольной группы вводят аналогичный объем физиологического раствора. Через 2 сут. животных забивают, выделяют печень и определяют продукты перекисного окисления липидов, такие как диеновые конъюгаты (появляются на начальных этапах перекисного окисления), гидроперекиси липидов (обнаруживаются на более поздних этапах перекисного окисления) и малоновый диальдегид (один из наиболее важных конечных продуктов перекисного окисления липидов).

а. Определение малонового диальдегида в гомогенате печени мыши.

Печень мыши растирают в гомогенезаторе Поттера в 3 мл 0,025 М

трис-HCl (pH 7,4), содержащей 0,175 М хлорида калия. Гомогенат по

2,5 мл помещают в центрифужные пробирки и осаждают белок

добавлением 1 мл 17%-ного раствора ТХУ (конечная концентрация 5%).

Образующийся осадок отделяют центрифугированием в течение 10 мин.

при 4000 g. Надосадочную жидкость переносят в пробирки, добавляют

по 1 мл 0,8%-ного водного раствора 2-тиобарбитуровой кислоты и

помещают пробы на 10 мин. в кипящую водяную баню. В качестве

контроля используют пробы, содержащие вместо надосадочной жидкости

буфер (pH 7,4). После развития розовой окраски пробы охлаждают до

комнатной температуры и измеряют оптическую плотность при 532 нм.

Количество малонового диальдегида рассчитывают, используя молярный

5 -1 -1

коэффициент экстикции 1,56 x 10 см x М , а полученный

результат выражают в н-молях на пробу (152).

б. Определение диеновой конъюгации полиненасыщенных высших жирных кислот в гомогенате печени мыши.

Печень мыши растирают в гомогенизаторе Поттера с 9 мл экстрагирующей смеси гептана с изопропиловым спиртом в объемном отношении 1:1. Полученную суспензию центрифугируют 10 мин. при 4000 g. Надосадочную фракцию переносят в пробирки и добавляют одну десятую часть объема дистиллированной воды. После 2-кратного встряхивания и расслаивания фаз отсасывают гитпановую фазу. К равным объемам по 0,5 мл добавляют этиловый спирт в отношении 1:5 - 1:10. Оптическую плотность проб измеряют при 233 нм. В качестве контроля используют только экстрагирующую смесь.

Содержание диеновых конъюгатов рассчитывают, исходя из

величины молярного коэффициента экстинкции при 233 нм для

5 -1 -1

сопряженных диенов ПНЖК, равного 2,2 x 10 см x М (152).

в. Определение гидроперекиси липидов в гомогенате печени мыши.

Печень мыши растирают в гомогенизаторе Поттера в 3 мл 0,025 М трис HCl буфера (pH 7,4), содержащей 0,175 М хлорида калия. Гомогенат по 2,0 мл помещают в центрифужные пробирки и осаждают белок добавлением 0,2 мл 50%-ного раствора ТХУ (конечная концентрация 5%). Образующийся осадок отделяют центрифугированием в течение 10 мин. при 4000 g. 2 мл надосадочной жидкости доводят 96%-ным этанолом до 27 мл. К равным объемам до 27 мл добавляют 0,2 мл концентрированной соляной кислоты и 0,025 мл 5%-ного раствора соли Мора в 3%-ной соляной кислоте, пробы интенсивно встряхивают. Точно через 30 с приливают 1 мл 20%-ного раствора тиоцианата аммония, после чего развивается малиновая окраска. В качестве контроля используют пробы, содержащие 96%-ный этанол вместо НЖ. Изменение оптической плотности проводят в течение 10 мин. после добавления тиоцианата аммония при 480 нм. Об относительном уровне гидроперекисей в биологическом материале судят по величине оптической плотности при 480 нм (152).

Общие положения 12.3. Экспериментальная схема модели на лабораторных животных для оценки эффективности профилактического действия парафармацевтиков