VII. Жидкостный хроматомасс-спектрометрический анализ проб сыворотки и плазмы крови, гомогенатов тканей лабораторных животных из эксперимента по моделированию вредного воздействия

7.1. УВЭЖХ-МС анализ - метод исследования, включающий хроматографическое разделение веществ пробы с последующим масс-спектрометрическим детектированием их аналитических сигналов. Хроматографическое разделение уменьшает взаимное влияние компонентов пробы в ионизационной камере масс-спектрометра: в результате последовательного элюирования снижается вероятность занижения или полного подавления аналитического сигнала веществ.

7.2. В течение всего времени проведения анализа пробы биоматериала хранят при температуре плюс 4 °C во избежание деградации проб.

7.3. Измерение проб биоматериала при проведении метаболомного исследования проводят в виде серии проб, включающей холостой анализ (далее - ХА, см. п. 7.5), уравновешивающие образцы контроля (далее - УОК, см. п. 7.6), холостые пробы (далее - ХП, см. п. 7.7), образцы контроля (см. п. 7.8), образцы контроля стабильности сигналов (далее - ОКС, см. п. 7.9), РП (см. п. 7.10).

7.4. Последовательность проведения серии измерений 20 проб представлена в табл. 3 [12]. При большем количестве РП серию измерений составляют в соответствии с пунктами 7.3, 7.5 - 7.10.

Таблица 3

Схема последовательности проведения серии измерений,

включающей 20 рабочих проб биологического материала

7.5. Включение ХА в процедуру анализа необходимо для выявления примесей веществ, содержащихся в подвижной фазе хроматографа, и которые не могут быть устранены заменой растворителей и промывкой хроматографической системы. Соответствующие данным веществам аналитические сигналы исключают из анализа при обработке данных РП и ОК на этапе поиска веществ (см. п. 7.19). ХА проводят без ввода пробы, с использованием хроматографического метода, применяемого для анализа РП (см. п.п. 7.11 и 7.12).

7.6. УОК представляет собой образец контроля, однако полученные при его анализе аналитические сигналы веществ в обработке данных результатов эксперимента не используют. УОК включают в процедуру анализа для фиксации матрицы пробы на хроматографической колонке и стабилизации времени удерживания компонентов проб при анализе.

7.7. Анализ ХП проводится для выявления веществ, вносимых в пробу в процессе пробоподготовки, и, таким образом, не несущих полезной информации о биоматериале. Кроме того, анализ ХП в конце серии проб необходим для обнаружения явления переноса - контаминации системы хроматографа. ХП приготавливается аналогично рабочим пробам (см. гл. VI), однако, вместо биоматериала добавляют равный объем воды, используемой при подготовке хроматографического элюента. Аналитические сигналы, найденные при анализе холостой пробы, исключаются при обработке данных РП и ОК на этапе поиска веществ (см. п. 7.19).

7.8. Результаты анализа ОК используют на этапе обработки данных: с их помощью производится отбор сигналов веществ, включаемых в дальнейший анализ (см. п. 7.19). Одна серия измерений включает минимум пять ОК, при этом два из них анализируют до и два после серии проб. Кроме того, ОК включают в аналитическую серию через каждые пять рабочих проб.

7.9. ОКС представляют собой ОК, по которым оценивается стабильность аналитической системы. По результатам расчета среднеквадратического отклонения (далее - СКО) значений величины сигналов и времени удержания веществ в данных пробах принимается решение о готовности хроматомасс-спектрометрической системы к анализу. В случае, когда СКО вышеупомянутых параметров превышают допустимую величину погрешности аналитической системы, проводят повторный анализ ОКС и повторяют процедуру проверки. В случае повторного превышения - проводят поиск и устранение причины.

7.10. В серии измерений РП анализируют в случайном порядке. Максимальное количество проб в серии определяется общим временем проведения анализа - оно не должно превышать 48 часов, при условии стабильности сигнала ВС (п. 7.16) и поддержании температуры проб не более плюс 4 °C [13].

7.11. Хроматографическое разделение метаболитов как полярной, так и неполярной фракций, осуществляют в градиентном режиме, начиная с подвижной фазы, обладающей наименьшей элюирующей способностью, и, с течением времени, увеличивая долю фазы с наибольшей элюирующей способностью.

7.12. Программа хроматографического градиента строится на основе объема применяемой аналитической колонки и скорости потока элюента и включает в себя следующие этапы:

- предварительное кондиционирование - промывка хроматографической системы 10 колоночными объемами стартового элюента, обладающего наименьшей элюирующей способностью;

- ввод пробы;

- градиентное элюирование - непрерывное изменение состава подвижной фазы с линейным увеличением содержания растворителя с сильной элюирующей способностью до концентрации, обеспечивающей выход всех веществ с колонки. Время градиентного элюирования подбирают таким образом, чтобы обеспечить прохождение через хроматографическую систему от 10 до 20 колоночных объемов элюента;

- промывка - элюирование из хроматографической колонки сильноудерживаемых веществ. Этап осуществляют пропусканием через хроматографическую систему 5 колоночных объемов растворителя с сильной элюирующей способностью;

- возврат к стартовым условиям - изменение состава элюента до стартовых значений, осуществляемое пропусканием через хроматографическую систему от 2 до 3 колоночных объемов подвижной фазы;

- конечное кондиционирование - промывка хроматографической системы 10 колоночными объемами стартового элюента.

7.13. При анализе серии проб предварительное кондиционирование колонки проводят только для первой пробы, конечное кондиционирование осуществляют после анализа каждой пробы.

7.14. Пример программ градиентного элюирования для предварительного хроматографического разделения фракций полярных и неполярных веществ проб биоматериала представлен в приложении 3 к настоящим МР.

7.15. Масс-спектрометрическое детектирование аналитических сигналов веществ в пробах биоматериалов осуществляют в режиме сканирования положительных и отрицательных ионов в диапазоне массово-зарядовых чисел (далее - m/z) от 50 до 1500.

7.16. Оперативный контроль процедуры анализа осуществляют посредством оценки стабильности сигнала ВС. Если в серии проб имеют место тенденции к увеличению или снижению сигнала более чем на 25% от среднего значения из всех предыдущих проб, то процедуру анализа останавливают до устранения причины возникновения отклонений. Если в отдельных РП или ОК наблюдают завышенные или заниженные значения сигнала ВС, не формирующие каких-либо закономерностей, то такие пробы исключают из дальнейшей обработки данных.

7.17. Обработку масс-хроматограмм полного ионного тока ХП, ОК и РП проводят в программном обеспечении производителя оборудования. Анализ масс-хроматограмм заключается в поиске и интегрировании сигналов квазимолекулярных ионов, соответствующих индивидуальным веществам. Результатом обработки масс-хроматограмм является перечень значений m/z ионов веществ, для которых указывают максимальное значение интенсивности аналитического сигнала, площадь и время удерживания его пика на хроматограмме.

7.18. В результаты анализа не включают вещества, обладающие интенсивностью аналитического сигнала менее, чем трехкратный уровень шума детектора и включающие менее двух изотопных пиков, а также обнаруживаемые в диапазонах пика ввода пробы и возврата хроматографического градиента к стартовым условиям.

7.19. С целью исключения из результатов анализа веществ, не относящихся к изучаемому в эксперименте воздействию, из данных, полученных при обработке ОК, отбрасывают все сигналы веществ, найденные в ХП. Оставшиеся вещества, присутствующие более чем в 70% проб ОК, включают в поиск при обработке данных анализа РП.

7.20. Для последующего анализа данных РП из эксперимента по моделированию вредного воздействия используют значения m/z ионов веществ, соответствующие им площади пиков аналитических сигналов и их время удерживания.