VI. Подготовка проб биологического материала лабораторных животных к жидкостному хроматомасс-спектрометрическому анализу

6.1. Подготовка биоматериала лабораторных животных из эксперимента по моделированию вредного воздействия производится единообразно, в короткий промежуток времени. Перед проведением подготовки пробы размораживают на льду или в холодильнике при температуре не выше плюс 4 °C.

6.2. Алгоритм пробоподготовки биологических образцов сыворотки и плазмы крови включает одновременное фракционирование, удаление высокомолекулярных веществ и устранение влияния солей. При этом процедуру составляют таким образом, чтобы минимизировать количество этапов и обеспечить сохранность как можно большего количества содержащихся в пробе низкомолекулярных веществ: фракционирование, депротеинизация и обессоливание проводятся в один этап.

6.3. Биологические образцы тканей перед подготовкой измельчают в ступке при температуре жидкого азота или автоматическом гомогенизаторе с охлаждением. Таким образом пробы тканей переводят в жидкое состояние для обеспечения возможности дальнейшей обработки аналогично пробам сыворотки и плазмы крови.

6.4. Фракционирование - этап подготовки проб биологических образцов, на котором осуществляется разделение веществ пробы на две фракции, одна из которых содержит относительно полярные, вторая - неполярные вещества. Это необходимо для дальнейшего жидкостно-хроматографического разделения компонентов пробы перед масс-спектрометрическим детектированием веществ.

6.5. Высокомолекулярные вещества подлежат удалению из биологических проб во избежание контаминации и закупорки колонки хроматографической системы, обладающей малым диаметром пор. Высокомолекулярные вещества в биологических пробах представлены белками и пептидами.

6.6. Удаление или уменьшение концентрации солей в пробах биоматериала необходимо для повышения интенсивности аналитических сигналов компонентов проб. Соли подавляют процессы ионизации органических молекул аналитов, происходящие в источнике ионов электрораспылительного типа. Это может привести к снижению интенсивности или исчезновению аналитического сигнала вещества.

6.7. Фракционирование, депротеинизация и удаление солей осуществляется с помощью двух вариантов:

1) добавлением композиций растворителей в процессе жидкостной экстракции низкомолекулярных метаболитов. Так, смесь ацетон-метанол используют для извлечения полярной фракции веществ пробы, пригодной для дальнейшего хроматографического разделения на сорбенте гидрофильных взаимодействий. Смесью хлороформ-метанол извлекают вещества липидной природы, хорошо разделяющиеся на обращенно-фазовой хроматографической колонке. Белки при этом выпадают в осадок вместе с неорганическими солями, обладающими худшей растворимостью в водных растворах органических растворителей. Влияние остаточного количества солей нивелируется за счет разбавления пробы;

2) использованием сорбентов различной полярности в процессе твердофазной экстракции метаболитов. Пробу пропускают через патрон, содержащий сорбент с диаметром пор до 120 ангстрем, удерживающий низкомолекулярные и пропускающий высокомолекулярные вещества и соли. Так, патроны с сорбентом с привитой фазой C18 извлекают вещества липидной природы, тогда как ионообменные картриджи удерживают на себе вещества, молекулы которых содержат полярные функциональные группы. Далее, промывочным растворителем очищают сорбент от высокомолекулярных веществ и солей, а сорбат смывают с патрона элюирующим растворителем. Из собранной фракции веществ пробы удаляют излишки растворителя и далее используют для анализа.

6.8. Подготовку проб ОК для сыворотки и плазмы крови, созданных во время пробоотбора (см. п. 5.2), проводят аналогично рабочим пробам (далее - РП). ОК для проб тканей составляют после проведения пробоподготовки, объединяя равные порции материала в одной емкости.

6.9. Для оперативного контроля процедуры анализа проб (см. п. 7.16) и учета возможных погрешностей в процессе пробоподготовки в пробы вводят известное количество вещества-стандарта (далее - ВС), удовлетворяющего следующим требованиям: стабильная ионизация в режиме генерации ионов методом электрораспыления, приемлемое удерживание на хроматографической колонке, изначальное отсутствие в анализируемых образцах. Результаты измерений аналитического сигнала ВС используют для нормализации аналитических сигналов веществ в пробах в процессе обработки данных (см. п. 8.5).

6.10. Пример подготовки биологических проб тканей, сыворотки и плазмы крови представлен в приложении 2 к настоящим МР.