IX. Процедура идентификации веществ, данные о которых получены в результате статистической обработки результатов хроматомасс-спектрометрического анализа биологических проб

9.1. Результаты статистической обработки представляют собой список веществ, для каждого из которых установлено m/z ионного аддукта и время удерживания. Количество данных веществ статистически значимо отличается в группах животных из эксперимента по моделированию вредного воздействия. С использованием m/z и времени удерживания веществ проводят их идентификацию.

9.2. Идентификация - установление молекулярной и структурной формул вещества. Идентификация может быть осуществлена с различной степенью достоверности: от низшей (V) до высшей (I) (см. табл. 4) [14]. Степени достоверности с IV по I, помимо обозначенного для них в таблице критерия, включают критерии низших степеней.

Таблица 4

Степени достоверности идентификации веществ

9.3. Для идентификации вещества с достоверностью IV степени необходимо установить молекулярную формулу, соответствующую рассматриваемому значению m/z. Подбор молекулярной формулы осуществляется посредством выполнения следующих этапов [15]:

- определение вида квазимолекулярного иона, установление моноизотопной массы нейтральной молекулы вещества (достижение V степени достоверности идентификации вещества);

- конструирование расчетным образом всех возможных молекулярных формул, масса которых лежит в пределах погрешности детектора масс-спектрометра;

- выбор наиболее вероятных молекулярных формул (например, оценка возможности существования структурной формулы, применение "азотного правила");

- сопоставление расчетного изотопного распределения для оставшихся молекулярных формул с полученным экспериментально - наиболее близкий вариант считают окончательным.

Приведенные этапы выполняют с помощью программного обеспечения, поставляемого с масс-спектрометром, либо общедоступных сервисов, например, ChemCalc <3>.

--------------------------------

<3> Официальный сайт программного обеспечения ChemCalc: www.chemcalc.org (в свободном доступе); примечание: допускается использование аналогичных или с лучшими характеристиками программных средств для подбора молекулярной формулы химического вещества.

9.4. При идентификации вещества с достоверностью I, II и III степени необходимо получить спектры фрагментации иона с соответствующим ему в пробе значением m/z. Для этого проводят повторный анализ проб в тандемном режиме масс-спектрометра, извлекая только интересующие ионы. Подвергая их фрагментации, регистрируют спектры осколочных ионов. Для генерации молекулярных формул фрагментов по алгоритму используют m/z осколочных ионов (см. п. 9.3). Состав и интенсивность сигнала осколочных ионов позволяет выдвинуть предположение о наличии тех или иных функциональных групп в веществе (степень достоверности идентификации III) [16]. Предположение о наиболее вероятной структурной формуле вещества (степень достоверности идентификации II) формируют, сравнивая фрагментационную картину молекулы вещества в РП с данными библиотек тандемных спектров HMDB <4>, MoNA <5>, MassBank <6>, METLIN <7>. Также учитывают биологический контекст, к примеру, особенности химического состава анализируемой пробы, и хроматографическое время удерживание - при различении возможных изомеров. В дополнение к спектрам фрагментации, для ограничения количества возможных кандидатов, может оказаться полезным поиск веществ по точной моноизотопной массе или молекулярной формуле в метаболомных базах данных: HMDB, LipidMaps <8>, KEGG <9>. Спектры фрагментации получают на разных уровнях энергии, сообщаемой квазимолекулярным ионам.

--------------------------------

<4> Официальный сайт базы данных Human Metabolome Database: hmdb.ca (в свободном доступе).

<5> Официальный сайт библиотеки масс-спектров MassBank of North America: mona.fiehnlab.ucdavis.edu (в свободном доступе).

<6> Официальный сайт библиотеки масс-спектров MassBank Europemassbank.eu/MassBank (в свободном доступе).

<7> Официальный сайт библиотеки масс-спектров METLIN:https://metlin.scripps.edu/ (в свободном доступе).

<8> Официальный сайт базы данных LIPID MAPS: www.lipidmaps.org (в свободном доступе).

<9> Официальный сайт Киотской энциклопедии генов и геномов: www.genome.jp/kegg (в свободном доступе).

9.5. Для достижения I степени достоверности идентификации вещества, необходимо иметь в распоряжении стандартный образец вещества, для сравнения с экспериментально полученными: m/z, хроматографическим временем удерживания и спектром фрагментации. Вещество из РП считают однозначно идентифицированным только при условии совпадения всех трех перечисленных характеристик.

9.6. По наличию или отсутствию критериев достоверности для каждого вещества (или значения m/z) присваивают уровень идентификации. Вещества со степенью достоверности идентификации I, II и III используют для интерпретации результатов эксперимента по моделированию вредного воздействия.