VI. Полногеномное секвенирование ДНК с использованием метода реверсивной терминации

6.1. Подготовка ДНК-библиотеки для секвенирования методом реверсивной терминации на оборудовании Genolab М с использованием набора Raissol Bio "SG GM" происходит в несколько этапов: фрагментация ДНК, лигирование адаптеров, очистка после лигирования, постановка индексной ПЦР, очистка после индексной ПЦР, измерение концентрации.

6.2. Для фрагментации ДНК необходимо внести 10 мкл ДНК с концентрацией 20 нг/мкл в стрипы или пробирки объемом 0,2 мл. Приготовить мастер-микс для фрагментации: буфер (3 в 1) - 13,4 мкл, 3-фермент - 1,6 мкл и ДНК-нуклеаза - 1 мкл. Мастер-микс добавить в образцы ДНК и поместить в амплификатор после выхода прибора в рабочее состояние после первого этапа. Программа для фрагментации: плюс 4 °C - , плюс 65 °C - 25 мин, плюс 75 °C - 10 мин и охлаждение образцов до плюс 4 °C.

6.3. Для лигирования адаптеров необходимо приготовить мастер-микс на необходимое количество реакций: лигазный буфер - 20,5 мкл, адаптеры - 3,5 мкл, лигаза - 1 мкл. Перемешать, сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования. После завершения программы фрагментации внести по 25 мкл получившегося мастер-микса к образцам. Поместить в амплификатор с установленной программой для лигирования: при температуре плюс 4 °C - , плюс 22 °C - 30 мин, плюс 4 °C - . После установки пробирок в амплификатор необходимо пропустить первый шаг.

6.4. После проведения лигирования необходимо провести очистку на магнитных частицах, для этого добавить 45 мкл магнитных частиц к каждому образцу и перемешать на вортексе до гомогенного состояния. Инкубировать 5 мин при комнатной температуре. Далее поместить образцы на магнитный штатив, инкубировать 3 - 5 мин до прозрачного раствора. После этого удалить супернатант. Дважды промыть 200 мкл 80% этанолом (свежеприготовленным). Удалить спирт. Далее необходимо высушить образцы с открытыми крышками при комнатной температуре в течение 10 мин до полного испарения остатков спирта. Добавить 24 мкл деионизированной, свободной от нуклеаз воды к магнитным частицам. Интенсивно перемешать пробирки на вортексе, сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования. Поместить образцы на магнитный штатив, инкубировать в течение 2 - 3 мин до прозрачного раствора. Перенести 22 мкл элюата в новые пробирки или стрипы, не захватывая магнитные частицы.

6.5. На этапе проведения индексной ПЦР к каждому образцу необходимо добавить по 2 мкл индивидуальных праймерных миксов. Далее необходимо приготовить мастер-микс на необходимое количество реакций: ПЦР буфер - 25 мкл, ПЦР фермент 1 - 0,5 мкл, ПЦР фермент 2 - 0,75 мкл. Перемешать мастер-микс, осадить. Внести по 26,25 мкл к каждому образцу. Поместить пробирки в амплификатор. Запустить программу для индексной ПЦР: при температуре плюс 95 °C - 2 мин, плюс 95 °C - 15 сек, плюс 56 °C - 30 сек, плюс 72 °C - 17 сек, плюс 72 °C - 2 мин, плюс 4 °C - .

6.6. После ПЦР-реакции необходимо провести очистку на магнитных частицах, для этого добавить 50 мкл магнитных частиц к каждому образцу, перемешать на вортексе до гомогенного состояния. Инкубировать 5 мин при комнатной температуре. Далее поместить образцы на магнитный штатив, инкубировать 3 - 5 мин до просветления раствора. После удалить супернатант. Дважды промыть 200 мкл 80% этанолом (свежеприготовленным). Спирт удалить. Далее необходимо высушить образцы с открытыми крышками при комнатной температуре в течение 10 мин до полного испарения остатков спирта. Добавить 22 мкл ТЕ буфера к осадку частиц. Интенсивно перемешать пробирки на вортексе, сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования. Поместить образцы на магнитный штатив, инкубировать в течение 2 - 3 мин до просветления раствора. Перенести 20 мкл элюата в новые пробирки или стрипы, не захватывая магнитные частицы. Концентрацию очищенных библиотек проверить на флуориметре.

6.7. Получившийся ПЦР-продукт нужно нормализовать до 4 нмоль в 20 мкл, разбавив водой лабораторного качества. Нормализованные библиотеки объединяют по 5 мкл каждого образца в пробирке на 1,5 мл - 2 мл. Картридж для секвенирования хранится при температуре минус 25 - минус 15 °C. Не позднее, чем за 2 часа до запуска, картридж помещают в водяную баню комнатной температуры. Заранее (минимум за 30 мин до запуска) нужно достать загрузочную проточную ячейку, которая хранится при температуре плюс 2 - 8 °C.

6.8. Полученный пул библиотек нужно денатурировать 0,2 н NaOH. В отдельную микроцентрифужную пробирку вносят 800 мкл воды и 200 мкл 1 н NaOH. В результате получают 1 мл 0,2 н NaOH. Раствор перемешивают, перевернув несколько раз. Полученный раствор используют в течение 12 часов. В микроцентрифужной пробирке смешивают 5 мкл 4 нмоль объединенных библиотек и 5 мкл 0,2 н NaOH, полученную смесь перемешивают на вортексе, после чего центрифугируют при 1700 об/мин в течение 1 мин и инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин. Для остановки реакции денатурации добавляют 5 мкл нейтрализующего реагента. Далее вносят 985 мкл гибридизующего реагента. 20 пмоль смесь библиотек готова. Для получения загрузочной концентрации (2,5 пмоль) в пробирку на 2 мл нужно внести 187,5 мкл смеси библиотек (концентрация 20 пмоль) и 1312,5 мкл гибридизующего реагента. Полученную пробирку с 2,5 пмоль библиотекой нужно поместить в загрузочный порт для образца в картридже.

6.9. Для подготовки секвенатора Genolab M к запуску необходимо включить прибор и запустить сопряженный с прибором системный блок. Перед тем, как начать процесс секвенирования, нужно осуществить промывку прибора. Зайти в программу, выбрать вкладку "Регулярная промывка". Для промывки используют промывочную ячейку и три промывочные картриджи, которые заполняются растворами: первый - Твин 20 0,05% (в 999,5 мл деионизованной воды растворить 500 мкл Твин 20); второй - 0,1 н NaOH (в 1 литре деионизованной воды растворить 4 г гидроксида натрия); третий - деионизованная вода. Суммарное время промывки - 50 мин. На сенсорной панели прибора необходимо проверить показатели температуры охлаждаемого контейнера для реагентов, она не должна превышать плюс 5 °C.

6.10. После промывки прибора в программе нужно выбрать вкладку "Секвенирование". Следующим этапом подгружается файл со всей информацией о запуске в формате ".csv". Нужно внести необходимую информацию в следующие ячейки: B2 - название эксперимента, A7 - количество циклов для первой нити ДНК, A8 - количество циклов для второй нити ДНК, B14 - необходимость демультиплексирования, начиная с ячейки A18 - название образцов, с ячейки F18 - последовательность индекса 1, с ячейки H18 - последовательность индекса 2.

6.11. Перед загрузкой необходимо сканировать штрих-код ячейки, который отображается на сенсорной панели. Перед загрузкой в прибор ячейку необходимо предварительно протереть в одном направлении безворсовой салфеткой, пропитанной 96% этанолом. В отсек для реагентов загружается картридж (блок A или блок B). Картридж предварительно необходимо встряхнуть, чтобы перемешать реагенты, и удалить крышку с пробирки исследуемого образца. Отсканировать штрих-код картриджа. После нажатия кнопки "начало" запустится процесс секвенирования. На сенсорной панели прибора будет отображаться время секвенирования, количество пройденных циклов, загрузка ячейки кластерами, шкала с качеством секвенируемых данных Q30. По окончании процесса секвенирования прибор промывается.