VII. Постановка ПЦР

7.1. Постановка ПЦР осуществляется с использованием набора реагентов с одним или двумя эндогенными контролями. Для проведения анализа рекомендуется использовать 10 мкл выделенной ДНК из цельной крови или сухих пятен крови человека.

7.2. В набор реагентов входят следующие смеси: ПЦР-буфер, ПЦР-смесь, калибраторы, K-(отрицательный контроль), готовые к использованию. Если Taq-полимераза не входит в состав ПЦР-буфера, то хранится в морозильной камере при температуре не выше минус 20 °C, реагент готов к употреблению и не требует размораживания. Перед применением все растворы (за исключением Taq-полимеразы) необходимо разморозить при комнатной температуре, аккуратно перемешать и осадить капли с крышки пробирки кратким центрифугированием в течение 1 - 3 с. Компоненты реакционной смеси смешивают непосредственно перед проведением ПЦР-исследования.

7.3. Отобрать необходимое для проведения анализа число пробирок объемом 0,2 мл или стрипированных пробирок, промаркировать и расположить в штативе из расчета, что каждый образец будет анализироваться в двух повторах при использовании набора с одним эндогенным повтором, в одном повторе при использовании набора с двумя эндогенными повторами. Расчет количества микропробирок производится по формуле (1):

Количество микропробирок = (2) n + 1, (1)

где: n - количество исследуемых образцов, включая калибраторы и К-.

7.4. В пробирке объемом 1,5 - 2 мл смешать реагенты для приготовления реакционной смеси из расчета на необходимое число микропробирок. Приготовленную смесь перемешать на вортексе и осадить капли с крышки пробирки кратким центрифугированием (1 - 3 с).

7.5. В каждую микропробирку объемом 0,2 мл внести по 15 мкл реакционной смеси. Неиспользованную смесь утилизировать.

7.6. Внести по 10 мкл калибраторов и контрольных образцов в соответствующие пробирки. В остальные внести по 10 мкл выделенных образцов ДНК. Закрыть крышки пробирок. Перед постановкой в ПЦР-машину рекомендуется осадить капли со стенок пробирок кратким центрифугированием (1 - 3 с). Срок годности приготовленной для работы смеси не более 2 ч.

7.7. Установить пробирки для ПЦР в блок амплификатора.

7.8. Запустить программное обеспечение амплификатора. Открыть созданный ранее шаблон или ввести параметры ПЦР, согласно инструкции набора (см. табл. 1), запустить программу амплификации.

Таблица 1

Условия проведения амплификации и детекции результатов

Продолжение табл. 1