|
Наименование метода
|
Тип метода
|
Принцип исследования
|
Ключевые показатели
|
Примечание
|
|
Аппликационные тесты (патч-тесты) на людях
|
In vivo
|
Аппликация тестируемого вещества на участок кожи предплечья или средней трети спины на гипоаллергенном пластыре с оценкой реакции на 2, 4, 7 дни
|
Кожные реакции
|
Применяется для оценки немедленной реакции
|
|
Многократная кожная аллергическая проба у человека (HRIPT)
|
In vivo
|
Многократная аппликация тестируемого вещества на участок кожи спины на гипоаллергенном пластыре с последующей накожной провокацией через 10 - 14 дней и оценкой реакции
|
Кожные реакции и специфическое изменение показателей крови
|
Применяется для подтверждения уровня, при котором не наблюдается эффекта индукции сенсибилизации кожи у нормальной популяции людей в условиях чрезмерного воздействия
|
|
Анализ реакции региональных лимфатических узлов
(Метод ОЭСР N 429,
ГОСТ 34556-2019)
|
In vivo
|
Индукция - мыши, накожное нанесение вещества в растворителе в течение 3 дней с последующим введением радиоактивной метки на 6 день. Через 5 часов животных умерщвляют и исследуют лимфоузлы
|
ИС; EC3
|
Применяется для оценки фазы индукции и классификации химического вещества по СГС
|
|
Анализ реакции региональных лимфатических узлов путем измерения содержания АТФ
(Метод ОЭСР N 442A,
Р 1.2.3156-13)
|
In vivo
|
Индукция - мыши, накожное нанесение 1% раствора лаурилсульфата натрия, далее вещества в растворителе в течение 3 дней и на 7 день с последующим умерщвлением животных через 24 часа и измерением содержания АТФ в лимфоцитах
|
ИС
|
Применяется для оценки фазы индукции без использования радиоактивной метки и классификации химического вещества по СГС
|
|
Анализ реакции региональных лимфатических узлов по измерению скорости включения бромдезоксиуридина
(Метод ОЭСР N 442B,
Р 1.2.3156-13)
|
In vivo
|
Индукция - мыши, накожное нанесение вещества в растворителе в течение 3 дней, на 5 день внутрибрюшинное введение бромдезоксиуридина с последующим умерщвлением животных через 24 часа и измерением скорости включения бромдезоксиуридина в лимфоузлы
|
ИС
|
Применяется для оценки фазы индукции без использования радиоактивной метки и классификации химического вещества по СГС
|
|
Тест на отек уха мыши
(MEST test)
(ГОСТ 32375-2013)
|
In vivo
|
Перед индукцией - внутрикожно полный адъювант Фрейнда. Индукция - накожное нанесение вещества в растворителе под пластырем на 1, 3 и 5-й дни после инъекции полного адъюванта Фрейнда.
Провокация - на 10 день после инъекции полного адъюванта Фрейнда накожное нанесение вещества в растворителе на одно ухо мыши с последующим измерением через 24 и 48 часов толщины ушной раковины
|
Изменение толщины ушной раковины (%)
|
Применяется на первом этапе оценки сенсибилизирующего потенциала химического вещества.
Выявляет сильные и умеренные сенсибилизаторы
|
|
Максимизационный тест на морских свинках (GPMT)
(Метод ОЭСР N 406,
ГОСТ 32375-2013)
|
In vivo
|
Морские свинки, индукция - три подкожных инъекции:
1) смесь 1:1 (по объему) полного адъюванта Фрейнда/вода или физиологический раствор;
2) исследуемое вещество в подходящем растворителе в выбранной концентрации;
3) исследуемое вещество в выбранной концентрации в смеси 1:1 (по объему) ПАФ/вода или физиологический раствор. Индукция - местное нанесение в течение 6 - 8 день (7 день), накожно под герметичной повязкой на 48 часов.
Провокация - местное на 20 - 22 день (21 день) накожная аппликация под герметичной повязкой на 24 часа
|
Оценка кожной реакции по шкале Магнусона-Клигмана
|
Применяется для классификации химического вещества по СГС
|
|
Тест Бюхлера
(Метод ОЭСР N 406,
ГОСТ 32375-2013)
|
In vivo
|
Морские свинки, индукция - местное нанесение под герметичной повязкой на 6 часов на 1, 6 - 8, 13 - 15 дни.
Провокация - местное нанесение вещества под герметичной повязкой на 6 часов на 27 - 29 дни в максимально возможной концентрации, не вызывающей раздражение
|
Оценка кожной реакции по шкале Магнусона-Клигмана
|
Применяется для классификации химического вещества по СГС
|
|
Внутрикожная сенсибилизация морских свинок
(МУ 1.1.578-96)
|
In vivo
|
Морские свинки, 50 и 200 мкг вещества однократно внутрикожно в наружную поверхность уха. Через 8 - 10 дней выявление сенсибилизации
|
Кожные реакции (провокационная кожная капельная проба, специфическое изменение показателей крови, аллерготест in vitro, реакция специфического лизиса, реакция специфического повреждения нейтрофилов; реакция специфической дегрануляции тучных клеток)
|
Используется в практике отечественной токсикологии
|
|
Комбинированная сенсибилизация морских свинок
(МУ 1.1.578-96)
|
In vivo
|
Морские свинки, 50 и 200 мкг вещества однократно внутрикожно в наружную поверхность уха. Через 8 - 10 дней выявление сенсибилизации - при отрицательном значении при 200 мкг - дополнительно 7 дней накожные аппликации, далее выявление сенсибилизации
|
Кожные реакции и специфическое изменение показателей крови
|
Используется в практике отечественной токсикологии
|
|
Многократные эпикутанные аппликации на морских свинках
(МУ 1.1.578-96)
|
In vivo
|
Морские свинки, накожные аппликации, 5 раз в неделю в течение 4 недель (всего 20), через 1 - 2 суток после последней аппликации выявление сенсибилизации
|
Кожные реакции (провокационная кожная капельная проба на другой бок)
|
Используется в практике отечественной токсикологии
|
|
Определение гиперчувствительности замедленного типа на мышах
(МУ 1.1.578-96)
|
In vivo
|
Мыши, 10 мМ или 100 мкг вещества в 60 мл смеси полного адьюванта Фрейнда и раствора Хенкса pH 7,5 (в соотношении 1/1), однократно, внутрикожно у основания хвоста.
Через 5 суток выявление сенсибилизации в подушечку задней лапы 10 мМ или 100 мкг вещества в растворе Хенкса, через 24 часа - толщина обеих задних лап в мм
|
Отек лап (разница в толщине обеих лап), измеренный микрометром
МК-0-25
|
Используется в практике отечественной токсикологии
|
|
Тест активации клеточной линии человека (h-CLAT)
(Метод ОЭСР N 442E)
|
In vitro
|
Позволяет количественно определять изменения экспрессии маркеров клеточной поверхности (CD86 и CD54) на клеточной линии моноцитарного лейкоза человека, клетках THP-1, после 24 часов воздействия тестируемого химического вещества методом проточной цитометрии после окрашивания клеток мечеными флуорохромом антителами
|
Количественная оценка изменения экспрессии маркеров клеточной поверхности CD54 и CD86, цитокина IL-8
|
Применяется для подтверждения сомнительных результатов испытаний in vivo на основе одного механизма каскада событий, приводящих к кожной сенсибилизации.
Самостоятельно не применяется для классификации химического вещества по СГС
|
|
Тест активации клеточной линии U937
(Метод ОЭСР N 442E)
|
In vitro
|
Измеряет индукцию маркера белка (CD86) в миелоидных клетках человека (U937) и продукцию цитокинов (например, TNF-альфа) после 45 часового воздействия тестируемого химического вещества методом проточной цитометрии
|
|
|
|
Анализ репортерного гена интерлейкина-8 (анализ IL-8 Luc)
(Метод ОЭСР N 442E)
|
In vitro
|
Измеряет изменение экспрессии IL-8, цитокина, связанного с активацией дендритных клеток в линии клеток IL-8, полученной из THP-1 методом изменения активности люциферазы
|
|
|
|
Метод определения люциферазы ARE-Nrf2.
Метод исследования KeratinoSens
(Метод ОЭСР N 442D,
ГОСТ 34896-2022)
|
In vitro
|
Основан на анализе репортерного гена люциферазы, контролируемого элементом антиоксидантного ответа гена AKR1C2 человека при использовании иммортализованной линии адгерентных клеток, полученных из человеческих кератиноцитов HaCat.
Позволяет выполнять количественные измерения индукции гена люциферазы (путем наблюдения за интенсивностью люминесценции) с использованием хорошо изученных фотогенных субстратов люциферазы в качестве индикатора активности фактора транскрипции Nrf2 в клетках после воздействия на них электрофильных испытуемых веществ
|
Превышение уровня индукции активности люциферазы заданного порога (увеличение на 50%) при концентрации химического вещества, не оказывающей существенного влияния на жизнеспособность клеток (>= 70%)
|
Применяется для подтверждения сомнительных результатов испытаний in vivo на основе одного механизма каскада событий, приводящих к кожной сенсибилизации.
Самостоятельно не применяется для классификации химического вещества по СГС
|
|
Метод определения люциферазы ARE-Nrf2
Метод исследования LuSens
(Метод ОЭСР N 442D,
ГОСТ 34896-2022)
|
In vitro
|
Основан на активации кератиноцитов, путем использования люциферазы для получения оценки интенсивности, опосредуемой через Nrf2 активации генов, связанных с элементом антиоксидантного ответа при использовании иммортализованной линии адгерентных клеток, полученных из человеческих кератиноцитов и стабильно содержащих репортерный ген люциферазы, контролируемый элементом антиоксидантного ответа гена крысы NQO1. Позволяет выполнять количественные измерения индукции гена люциферазы (путем наблюдения за интенсивностью люминесценции) с использованием хорошо изученных фотогенных субстратов люциферазы в качестве индикатора активности фактора транскрипции Nrf2 в клетках после воздействия на них электрофильных химических веществ
|
Превышение уровня индукции активности люциферазы заданного порога (увеличение на 50%) при концентрации химического вещества, не оказывающей существенного влияния на жизнеспособность клеток (>= 70%)
|
Применяется для подтверждения сомнительных результатов испытаний in vivo на основе одного механизма каскада событий, приводящих к кожной сенсибилизации.
Самостоятельно не применяется для классификации химического вещества по СГС
|
|
Прямой анализ реакционной способности в отношении пептидов (DPRA)
(Метод ОЭСР N 442C,
ГОСТ 34899-2022)
|
In chemico
|
Основан на ковалентном связывании низкомолекулярных веществ ("гаптенов") с белками кожи.
Позволяет количественно определить остаточную концентрацию цистеин- или лизин-содержащего пептида после 24 часов инкубации с тестируемым химическим веществом при температуре плюс 22,5 - 30 °C методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием ультрафиолетового детектора
|
Результат - образование гаптен-белкового комплекса. Измерение % связывания (истощения цистеина или лизина)
|
Применяется для подтверждения сомнительных результатов испытаний in vivo на основе одного ключевого события (механизма) каскада событий, приводящих к кожной сенсибилизации.
Самостоятельно не применяется для классификации химического вещества по СГС
Не применяется для оценки химических веществ, являющихся "прогаптенами" (химические вещества, которые обычно требуют метаболического превращения перед взаимодействием с белками кожи)
|
|
Анализ истощения глутатиона (GSH)
(ГОСТ 34877.1-2022,
ГОСТ 34877.2-2022)
|
In chemico
|
Основан на определении непрореагировавшего глутатиона колориметрически или методом ВЭЖХ после инкубации химического вещества с избытком восстановленного глутатиона в течение 2 часов при температуре плюс 25 °C в буферном растворе
|
RC50 - концентрация тестируемого химического вещества, при которой тиоловые группы глутатиона вступают в реакцию на 50% за 120 минут
|
Выявляет слабую электрофильную активность. Самостоятельно не применяется для классификации химического вещества по СГС
|
|
Анализ образования аддуктов методом жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией
|
In chemico
|
Количественное определение образовавшихся аддуктов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием после инкубирования тестируемого химического вещества с модельным нуклеофилом - химическим веществом, содержащим нуклеофильные группы (например, цистеиновый пептид)
|
Измерение процента образовавшегося аддукта или доли прореагировавшего нуклеофила
|
Результатом является предположение о возможном наличии сенсибилизирующего действия.
Самостоятельно не применяется для классификации химического вещества по СГС
|
|
Программное обеспечение (например, ОЭСР QSAR Tool box, VEGA Qsar, AMBIT, Toxtree, CAESAR software, Danish (Q)SAR Database)
|
In silico
|
Математическое моделирование
|
Расчет показателей, прогноз наличия и (или) отсутствия эффекта
|
Самостоятельно не применяется для классификации химического вещества по СГС
|