3.7. Метод твердофазного неконкурентного непрямого ИФА - метод, основанный на применении АГ и АТ, фиксированных на нерастворимых носителях.

3.7.1. Биоматериал: сыворотка венозной крови. Отбор, транспортировка и хранение биологического материала (см. п. 2.8).

3.7.2. Список исследуемых аллергенов представлен в приложении 4 к настоящим МР.

3.7.3. Оборудование и материалы, необходимые при работе.

3.7.3.1. Для ручной постановки (см. п. 3.1.4.1).

Состав набора реагентов <41>:

--------------------------------

<41> Примечание: допускается использование других реагентов с аналогичными характеристиками.

- полистироловый 96-луночный наборный планшет в составе: 8-луночный стрип, покрытый анти-IgG-AT (референс-стрип); стрипы с адсорбированными аллергенами;

- полистироловый 96-луночный наборный планшет в составе: 8-луночный стрип, покрытый анти-IgG4-AT (референс-стрип); стрипы с адсорбированными аллергенами;

- калибровочные пробы для определения IgG: калибровочная проба 0, содержащая 0 мкг/мл; калибровочная проба D, содержащая 0,5 мкг/мл; калибровочная проба C, содержащая 1 мкг/мл; калибровочная проба B, содержащая 2 мкг/мл; калибровочная проба A, содержащая 5 мкг/мл;

- калибровочные пробы для определения IgG 1, 4: калибровочная проба 0, содержащая 0 нг/мл; калибровочная проба D, содержащая 15 нг/мл; калибровочная проба C, содержащая 50 нг/мл; калибровочная проба B содержащая 150 нг/мл; калибровочная проба A, содержащая 500 нг/мл;

- коньюгат МКАТ анти-IgG, 100-кратный концентрат;

- коньюгат МКАТ анти-IgG1, 100-кратный концентрат;

- коньюгат МКАТ анти-IgG4, 100-кратный концентрат;

- промывающий раствор, 10-кратный концентрат;

- ТМБ;

- стоп-реагент;

- трафарет для анализа;

- инструкция по применению;

- паспорт.

3.7.3.2. Для автоматической постановки (см. п. 3.1.4.2).

Состав набора реагентов <42>:

--------------------------------

<42> Примечание: допускается использование других реагентов с аналогичными характеристиками.

- полистироловый 96-луночный пластиковый планшет в составе: 8-луночный стрип, покрытый анти-IgG-AT (референс-стрип); стрипы с адсорбированными аллергенами;

- калибровочные пробы для определения IgG1: калибровочная проба 0, содержащая 0 МЕ/мл; калибровочная проба, содержащая 0,5 МЕ/мл; калибровочная проба, содержащая 1 МЕ/мл; калибровочная проба, содержащая 5 МЕ/мл; калибровочная проба, содержащая 25 МЕг/мл; калибровочная проба, содержащая 100 МЕг/мл;

- калибровочные пробы для определения IgG4: калибровочная проба 0, содержащая 0 МЕ/мл; калибровочная проба, содержащая 0,5 МЕ/мл; калибровочная проба, содержащая 1 МЕ/мл; калибровочная проба, содержащая 5 МЕ/мл; калибровочная проба, содержащая 25 МЕг/мл; калибровочная проба, содержащая 100 МЕг/мл;

- контрольная сыворотка с известным содержанием IgG 1, 4;

- коньюгат МКАТ анти-IgG 1, 4, 100-кратный концентрат;

- промывающий раствор, 10-кратный концентрат;

- ТМБ;

- стоп-реагент;

- трафарет для анализа;

- инструкция по применению;

- паспорт.

3.7.4. Методика.

Метод твердофазного неконкурентного непрямого ИФА (см. п. 3.1.5).

3.7.5. Интерпретация результатов определения уровня содержания специфических IgG (табл. 3.6) проводится с учетом методики, в соответствии с инструкциями производителей наборов реагентов/тест-систем и оборудования (список исследуемых аллергенов представлен в приложениях 4, 5 к настоящим МР).

Таблица 3.6

Интерпретация результатов содержания IgG в сыворотке крови

3.8. BAT.

3.8.1. Принцип метода: BAT основан на экспрессии рецепторов к IgG на поверхности базофилов, что при взаимодействии IgG с аллергеном приводит к высвобождению вазоактивных медиаторов и появлению новых молекул.

3.8.2. Биоматериал: гепаринизированные образцы цельной крови. Отбор, транспортировка и хранение биологического материала (см. п. 2.8).

3.8.3. Список исследуемых аллергенов представлен в приложении 4 к настоящим МР.

3.8.4. Оборудование и материалы, необходимые при работе.

3.8.4.1. Для автоматической постановки:

1) оборудование <43>:

--------------------------------

<43> Примечание: допускается использование оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

- автоматизированный проточный цитометр со стандартными источниками синего (488 нм) и красного (638 нм) лазера;

2) расходные материалы <44>:

--------------------------------

<44> Примечание: допускается использование расходных материалов с аналогичными или лучшими характеристиками.

- перчатки резиновые;

- вода дистиллированная, ГОСТ 58144-2018;

- дезинфицирующие средства.

3) Набор реагентов, совместимых с методикой <45>.

--------------------------------

<45> Примечание: допускается использование других реагентов с аналогичными характеристиками. Состав набора может меняться в зависимости от производителя.

Состав набора реагентов:

- коктейль антител CRTH2-FITC/CD203c-PE/CD3-PC7;

- положительный контроль IgE-опосредованной активации базофилов;

- раствор для активации базофилов in vitro;

- раствор для остановки реакции активации;

- лизирующий раствор;

- фиксирующий раствор.

3.8.5. Методика:

- добавить 20 мкл PBS (фосфатно-солевой буфер) в пробирку "Neg" (отрицательный контроль); 20 мкл лизирующего раствора положительный контроль в пробирку "Pos" (положительный контроль); 20 мкл анализируемого аллергена в пробирку "Test" (различные разведения аллергена);

- добавить в каждую пробирку по 20 мкл реагента CRTH2-FITC/CD203c-PE/CD3-PC7;

- добавить в каждую пробирку по 100 мкл цельной крови;

- перемешать содержимое каждой пробирки на вортексе и инкубировать на водяной бане в течение 15 минут при температуре плюс 37 °C в защищенном от света месте;

- добавить в каждую пробирку по 100 мкл раствора для остановки реакции и перемешать на вортексе в течение 5 секунд;

- добавить в каждую пробирку по 2 мл раствора для лизирования с одновременной фиксацией и перемешать;

- инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре (плюс 18 - 25 °C) в защищенном от света месте.

- отцентрифугировать пробирки в течение 5 минут при 200 об/мин и удалить супернатант аспирацией;

- добавить в каждую пробирку по 3 мл PBS;

- отцентрифугировать пробирки в течение 5 минут при 200 об/мин и удалить супернатант аспирацией;

- ресуспендировать осадок клеток в 0,5 мл 0,1% раствора формальдегида в PBS;

- проанализировать пробы на проточном цитофлуориметре.

3.8.6. Интерпретация результатов оценки уровня содержания специфических IgG (табл. 3.7) проводится с учетом методики, в соответствии с инструкциями производителей наборов реагентов/тест-систем и оборудования (список исследуемых аллергенов представлен в приложениях 4, 5).

Таблица 3.7

Интерпретация результатов содержания специфических IgG

3.9. Тест трансформации лимфоцитов.

3.9.1. Принцип метода: выявление аллергической клеточно-опосредованной сенсибилизации (аллергия IV типа) на определенный компонент.

3.9.2. Биоматериал: цельная кровь с литий-гепарином. Отбор, транспортировка и хранение биологического материала (см. п. 2.8).

3.9.3. Оборудование, материалы и реагенты, необходимые при работе.

1) оборудование <46>:

--------------------------------

<46> Примечание: допускается использование оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

- бинокулярный световой микроскоп с увеличением 40x/0,65; 100x/1 (например, Микмед-5);

- термостат, поддерживающий температуру (37 +/- 1) °C;

- холодильник бытовой;

- стакан мерный вместимостью 25 мл, исполнения 2, 1 или 2 класса точности, ГОСТ 1770-74;

- пробирки стерильные вместимостью 5 мл, исполнения 2, 1 или 2 класса точности, ГОСТ 1770-74.

2) расходные материалы <47>:

--------------------------------

<47> Примечание: допускается использование расходных материалов с аналогичными или лучшими характеристиками.

- предметные и покровные стекла;

- бумага фильтровальная, ГОСТ 12026-76;

- дезинфицирующие средства;

- контейнер для сбора твердых отходов;

- контейнер для слива отработанных жидкостей.

3) Реагенты <48>:

--------------------------------

<48> Примечание: допускается использование других реагентов с аналогичными характеристиками. Состав набора может меняться в зависимости от производителя.

- набор красок для окрашивания по Романовскому-Гимзе <49>;

--------------------------------

<49> Приказ Минздрава России от 29.04.2025 N 258н.

- масло иммерсионное;

3.9.4. Методика:

- отстоять кровь до получения четкого разделения эритроцитов и плазмы;

- полученную плазму поместить в стерильные флаконы со средой 199 и антибиотиками;

- в контрольные образцы добавить изотонический раствор, а в опытные - исследуемый антиген или митоген;

- инкубировать при температуре плюс 37 °C в течение 24 - 72 часов (для митогенов);

- для оценки пролиферации клеток в ответ на антиген время культивирования может быть увеличено до 6 - 7 суток;

- надосадочную жидкость ресуспендировать в среде 199, центрифугировать 15 - 20 минут 1500 об/мин, удалить надосадочную жидкость, добавить уксусную кислоту, повторно центрифугировать;

- осадок перенести на предметное стекло и окрасить по Романовскому-Гимзе;

- микроскопировать в иммерсионной системе, провести учет результатов.

Примечание: подсчитывают число малых лимфоцитов (диаметр клеток 7 - 7,5 мкм), бластоподобных переходных форм (8 - 14 мкм) и бластов (более 14 мкм); для корректной оценки процента бластной трансформации необходим подсчет 200 - 300 клеток. Провести учет спонтанной и стимулированной бластной трансформации.

3.9.5. Интерпретация: показатели в пределах нормы - уровень спонтанной реакции бластной трансформации лимфоцитов до 10%, стимулированной митогеном - 40 - 70%.

3.10. Определение HLA не является в полной мере методом выявления сенсибилизации, но в отсутствии других лабораторных тестов, также может стать доказательством лекарственной сенсибилизации.