3.1. Метод твердофазного неконкурентного непрямого ИФА.

3.1.1. Метод твердофазного неконкурентного непрямого ИФА основан на применении антител (далее - АТ) и АГ фиксированных на нерастворимых носителях.

3.1.2. Биоматериал: сыворотка венозной крови. Отбор, транспортировка и хранение биологического материала (см. п. 2.8).

3.1.3. Список исследуемых аллергенов представлен в приложении 4 к настоящим МР.

3.1.4. Оборудование, расходные материалы и реактивы, необходимые при работе.

3.1.4.1. Для ручной постановки:

1) оборудование <19>:

--------------------------------

<19> Примечание: допускается использование оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

- фотометр вертикального сканирования, позволяющий производить измерение оптической плотности в лунках планшета при длине волны 450 нм (основная) и 620 нм (референсная);

- пипетки полуавтоматические одноканальные и многоканальные варьирующие со сменными наконечниками, позволяющие отбирать объемы жидкости 10 - 1000 мкл, аттестованные по значению средней дозы и сходимости результатов пипетирования (ошибка +/- 3%);

- цилиндр мерный вместимостью 500 мл, исполнения 2, 1 класса точности, ГОСТ 1770-74;

- стакан мерный вместимостью 25 мл, исполнения 2, 1 или 2 класса точности, ГОСТ 1770-74;

- прибор для встряхивания рамки со стрипами (шейкер);

- термостат, поддерживающий температуру (37 +/- 1) °C;

- холодильник бытовой.

2) расходные материалы <20>:

--------------------------------

<20> Примечание: допускается использование расходных материалов с аналогичными или лучшими характеристиками.

- бумага фильтровальная, ГОСТ 12026-76;

- вода дистиллированная, ГОСТ 58144-2018;

- дезинфицирующие средства;

- контейнер для сбора твердых отходов;

- контейнер для слива отработанных жидкостей;

- перчатки резиновые.

3) Набор реагентов, совместимых с методикой <21>:

--------------------------------

<21> Примечание: допускается использование реагентов с аналогичными или лучшими характеристиками.

- полистироловый 96-луночный наборный планшет в составе: 8-луночный стрип, покрытый анти-IgE-AT (референс-стрип); стрипы, покрытые аллергенами;

- калибровочные пробы для определения IgE: калибровочная проба 0, содержащая 0 мкг/мл; калибровочная проба D, содержащая 0,5 мкг/мл; калибровочная проба C, содержащая 1 мкг/мл; калибровочная проба B, содержащая 2 мкг/мл; калибровочная проба A, содержащая 5 мкг/мл;

- коньюгат моноклональных антител (далее - МКАТ) анти-IgE, 100-кратный концентрат;

- промывающий раствор, 10-кратный концентрат;

- ТМБ;

- стоп-реагент;

- трафарет для анализа;

- инструкция по применению;

- паспорт.

3.1.4.2. Для автоматической постановки:

1) Оборудование <22>:

--------------------------------

<22> Примечание: допускается использование оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

- автоматический ИФА-анализатор открытого типа, с возможностью регистрации оптической плотности при длине волны 450 нм (основной) и 620 нм (референсной);

- холодильник бытовой;

- дозаторы полуавтоматические одноканальные с переменным или фиксированным объемом со сменными наконечниками, позволяющие отбирать объемы жидкости от 5 до 1000 мкл;

- цилиндр мерный вместимостью 1000 мл, ГОСТ 1770-74.

2) расходные материалы <23>:

--------------------------------

<23> Примечание: допускается использование расходных материалов с аналогичными или лучшими характеристиками.

- перчатки резиновые;

- вода дистиллированная, ГОСТ 58144-2018;

- контейнер для сбора твердых отходов;

- контейнер для слива отработанных жидкостей;

- дезинфицирующие средства.

3) Набор реагентов, совместимых с методикой <24>:

--------------------------------

<24> Примечание: допускается использование реагентов с аналогичными или лучшими характеристиками.

Состав набора на примере набора реагентов от производителя ГК "АлкорБио" (состав набор может меняться в зависимости от производителя):

- полистироловый 96-луночный наборный пластиковый планшет в составе: 8-луночный стрип, покрытый анти-IgE-AT (референс-стрип), стрипы, покрытые аллергенами;

- калибровочные пробы для определения IgE: калибровочная проба 0, содержащая 0 МЕ/мл; калибровочная проба, содержащая 0,5 МЕ/мл; калибровочная проба, содержащая 1 МЕ/мл; калибровочная проба, содержащая 5 МЕ/мл; калибровочная проба, содержащая 25 МЕг/мл; калибровочная проба, содержащая 100 МЕг/мл;

- контрольная сыворотка с известным содержанием IgE;

- коньюгат МКАТ анти-IgE, 100-кратный концентрат;

- промывающий раствор, 10-кратный концентрат;

- ТМБ;

- стоп-реагент;

- трафарет для анализа;

- инструкция по применению;

- паспорт.

3.1.5. Проведение методики:

3.1.5.1. Сорбция АГ. В каждую лунку 96-луночного планшета внести 0,1 - 0,5 мкг АГ и 100 мкл 0,05 М карбонат-бикарбонатного буферного раствора (pH 9,6), произвести сорбцию при температуре плюс 4 °C в течение 16 часов. Произвести инкубацию при встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов. Отмыть (двукратно) не связавшиеся молекулы АГ фосфатно-солевым буферным раствором (pH 9,0), содержащим 0,1% твин-20 (по 300 мкл на лунку).

3.1.5.2. Блокировка. Лунки планшета заполнить фосфатно-солевым буферным раствором (pH 9,0), содержащим 1% раствор бычьего сывороточного альбумина или других белков (например, казеина, желатина, сухого молока), и инкубировать 10 - 15 минут при температуре плюс 18 - 25 °C.

3.1.5.3. Титрование специфических АТ. АТ титруют в серийных разведениях параллельно со стандартным образцом (СО). В первую лунку ряда внести готовое разведение АТ - в среднем 1 - 10 мкг на лунку, произвести последовательное разведение АТ в лунках. Инкубировать со специфическими АТ, конъюгированные с ферментной меткой, 30 минут при комнатной температуре при встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов. Отмыть 3 - 4 раза с помощью фосфатно-солевого буферного раствора pH 9,0, содержащего 0,1% твин-20.

3.1.5.4. Проведение ферментативной реакции, сопровождающейся появлением окрашенного продукта. В лунки внести по 100 мкл раствора субстрата и инкубировать 10 минут при комнатной температуре и постоянном перемешивании. Для остановки ферментативной реакции применять "стоп реагент", добавлять во все исследуемые и контрольные пробы в равных количествах. Методом колориметрии определить концентрацию окрашенного продукта, используя инструкцию от производителя набора реагентов/тест-систем произвести интерпретацию полученных результатов.

3.1.6. Интерпретация результатов определения уровня содержания специфических IgE (табл. 3.1) проводится с учетом методики, в соответствии с инструкциями производителей наборов реагентов/тест-систем и оборудования (список исследуемых аллергенов представлен в приложениях 4, 5 к настоящим МР).

Таблица 3.1

Интерпретация результатов содержания IgE в сыворотке крови

3.2. Иммунохроматографический метод.

3.2.1. Качественное экспресс определение методом ИХА.

3.2.2. Биоматериал: сыворотка венозной крови.

3.2.3. Список исследуемых аллергенов представлен в приложении 4 к настоящим МР.

3.2.4. Оборудование и материалы <25>:

--------------------------------

<25> Примечание: допускается использование оборудования и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

- центрифуга 1500 об/мин;

- набор тест-систем, совместимых с методикой.

3.2.5. Методика (см. прилагаемую инструкцию к набору теста):

- смешение исследуемой сыворотки венозной крови с буфером;

- добавление пробы на зону для образца;

- ожидание в течение 5 - 15 минут, пока фронт жидкости пройдет по мембране и появятся цветные тестовая и контрольная линии;

- визуальная оценка результата с использованием инструкции от производителя набора тест-систем.

3.2.6. Интерпретация результатов определения уровня содержания специфических IgE проводится с учетом методики, в соответствии с инструкциями производителей наборов реагентов/тест-систем и оборудования (список исследуемых аллергенов представлен в приложениях 3, 4 к настоящим МР):

1 - тестовая линия (T) и контрольная линия (C) окрашены - результат теста положительный;

2 - тестовая линия (T) не окрашена, но контрольная линия (C) окрашена - результат теста отрицательный;

3 - тестовая линия (T) и контрольная линия (C) не окрашены - результат теста недействительный;

4 - тестовая линия (T) окрашена, но контрольная линия (C) не окрашена - результат теста недействительный.

3.3. Метод иммуноблоттинга.

3.3.1. Иммуноблоттинг (иммуноблот) - метод выявления антител к отдельным антигенам, основанный на постановке иммуноферментного анализа на нитроцеллюлозных мембранах.

3.3.2. Биоматериал: сыворотка венозной крови.

3.3.3. Список исследуемых аллергенов представлен в приложении 3 к настоящим МР.

3.3.4. оборудование и материалы, необходимые при работе.

3.3.4.1. Для ручной постановки:

1) Оборудование <26>:

--------------------------------

<26> Примечание: допускается использование оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

- орбитальное качающее устройство или качающее устройство (например, КУ-400);

- аспиратор вакуумный;

- пинцет пластмассовый;

- пипетки автоматические одноканальные со сменными наконечниками, позволяющие отбирать объемы жидкостей от 0,01 мл до 5,0 мл, аттестованные по значению средней дозы и сходимости результатов пипетирования (погрешность не более 3%);

2) расходные материалы <27>:

--------------------------------

<27> Примечание: допускается использование расходных материалов с аналогичными или лучшими характеристиками.

- цилиндры мерные вместимостью 10 мл и 200 мл, ГОСТ 1770-74;

- стаканы мерные вместимостью 10 мл и 200 мл, ГОСТ 1770-74;

- перчатки резиновые;

- вода дистиллированная, ГОСТ 58144-2018;

- контейнер для сбора твердых отходов;

- контейнер для слива отработанных жидкостей;

- флаконы стеклянные вместимостью 20 мл;

- бумага фильтровальная, ГОСТ 12026-76;

- одноразовая посуда для приготовления рабочих растворов конъюгата и хромогена;

3) Набор реагентов, совместимых с методикой <28>:

--------------------------------

<28> Примечание: допускается использование других реагентов с аналогичными характеристиками. Состав набора может меняться в зависимости от производителя.

Состав набора на примере набора реагентов от производителя:

- тестовые стрипы, покрытые антигенами IgE;

- контрольная сыворотка с известным содержанием IgE;

- ферментный конъюгат;

- универсальный буфер;

- раствор субстрата: нитросиний тетразолий хлорид/5-бром-4-хлор-3-индолил-фосфат (NBT/BCIP), готов к использованию;

- лоток для инкубации;

- инструкция по применению набора;

- паспорт набора.

3.3.4.2. Для автоматической постановки:

1) оборудование <29>:

--------------------------------

<29> Примечание: допускается использование оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

- прибор для автоматизации иммуноблота;

- холодильник бытовой;

- дозаторы полуавтоматические одноканальные с переменным или фиксированным объемом со сменными наконечниками, позволяющие отбирать объемы жидкости от 5 до 1000 мкл;

2) расходные материалы <30>:

--------------------------------

<30> Примечание: допускается использование расходных материалов с аналогичными или лучшими характеристиками.

- перчатки резиновые;

- цилиндр мерный вместимостью 1000 мл, ГОСТ 1770-74;

- вода дистиллированная, ГОСТ 58144-2018;

- дезинфицирующие средства.

3) Набор реагентов, совместимых с методикой <31>:

--------------------------------

<31> Примечание: допускается использование других реагентов с аналогичными или лучшими характеристиками.

Состав набора (см. п. 3.3.4.1).

3.3.5. Методика:

- подготовка нитроцеллюлозной мембраны с аллергенами;

- внесение сыворотки больного (специфические АТ связываются с соответствующими АГ);

- добавление АТ против иммуноглобулинов человека, меченных ферментом;

- добавление субстрата и учет реакции.

3.3.6. Интерпретация результатов определения уровня содержания специфических IgE (табл. 3.2) проводится с учетом методики, в соответствии с инструкциями производителей наборов реагентов/тест-систем и оборудования (список исследуемых аллергенов представлен в приложениях 4, 5 к настоящим МР).

Таблица 3.2

Интерпретация результатов содержания IgE в сыворотке крови

3.4. Иммунофлюоресцентный анализ (технология ImmunoCAP).

3.4.1. Иммунофлюоресцентный анализ ImmunoCAP - метод выявления специфических АГ к широкому спектру аллергокомпонентов (112 единиц) из 51-го источника аллергенов с помощью IgE конъюгированных с флюорохромом.

3.4.2. Биоматериал: сыворотка венозной крови. Отбор, транспортировка и хранение биологического материала (см. п. 2.8).

3.4.3. Список исследуемых аллергенов представлен в приложении 4 к настоящим МР.

3.4.4. Оборудование и материалы, необходимые при работе.

1) оборудование <32>:

--------------------------------

<32> Примечание: допускается использование оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

- автоматизированный проточный цитометр со стандартными источниками синего (488 нм) и красного (638 нм) лазера;

2) расходные материалы <33>:

--------------------------------

<33> Примечание: допускается использование расходных материалов с аналогичными или лучшими характеристиками.

- перчатки резиновые;

- вода дистиллированная, ГОСТ 58144-2018;

- дезинфицирующие средства;

- контейнер для сбора твердых отходов;

- контейнер для слива отработанных жидкостей;

3) Набор реагентов <34>.

--------------------------------

<34> Примечание: допускается использование других реагентов с аналогичными характеристиками.

Состав набора in vitro:

- ImmunoCAP ISAC 112i Chip, чип;

- ImmunoCAP ISAC E Detection Antibody, конъюгат;

- ImmunoCAP ISAC E Control, калибратор;

- инструкция по применению.

3.4.5. Методика:

- сбалансированная смесь специфических ингаляционных аллергенов (Phadiatop), либо индивидуальный специфический аллерген (в зависимости от выбранной методики), ковалентно связанные с ImmunoCAP, реагируют со специфическими IgE в образце сыворотки пациента. Комплекс "АГ-АТ" связываются меченные ферментом АТ против IgE;

- инкубация с проявляющим реагентом и измерение уровня флюоресценции элюата по калибровочной кривой.

3.4.6. Интерпретация результатов определения уровня содержания специфических IgE (табл. 3.3) оценивается с учетом методики, в соответствии с инструкциями производителей наборов реагентов/тест-систем и оборудования (список исследуемых аллергенов представлен в приложениях 4, 5 к настоящим МР).

Таблица 3.3

Интерпретация результатов содержания IgE в сыворотке крови

3.5. Твердофазный ИФА (технология Alex).

3.5.1. Технология Alex - метод твердофазного неконкурентного непрямого ИФА, количественное определение соединений комплекса "антиген-антитело".

3.5.2. Биоматериал: сыворотка венозной крови. Отбор, транспортировка и хранение биологического материала (см. п. 2.8).

3.5.3. Список исследуемых аллергенов представлен в приложении 4 к настоящим МР.

3.5.4. Оборудование и материалы, необходимые при работе.

3.5.4.1. Для ручной постановки см. п. 3.1.4.1 и набор реагентов Allergy Explorer2/50.

Состав набора Allergy Explorer2/50:

- аллергочип Alex2 (англ. Alex2 Cartridge);

- промывающий раствор Alex2 (англ. Alex2 Washing Solution);

- разбавитель образца Alex2 (англ. Alex2 Sample Diluent);

- детектирующие антитела Alex2 (англ. Alex2 Detection Antibody);

- субстратный раствор Alex2 (англ. Alex2 Substrate Solution);

- стоп-реагент Alex2 (англ. Alex2 Stop Solution);

- инструкция по эксплуатации в комплекте поставки.

3.5.4.2. Для автоматической постановки см. 3.1.4.2 и набор реагентов Allergy Explorer2/50.

3.5.5. Методика:

- сбалансированная смесь специфических ингаляционных аллергенов (Phadiatop), либо индивидуальный специфический аллерген (в зависимости от выбранной методики), ковалентно связанные с ImmunoCAP, реагируют со специфическими IgE в образце сыворотки пациента;

- комплекс "АГ-АТ" связываются меченным ферментом АТ против IgE;

- инкубация с проявляющим реагентом и измерение уровня флюоресценции элюата по калибровочной кривой.

3.5.6. Интерпретация результатов определения уровня содержания специфических IgE (табл. 3.4) определяется с учетом методики в соответствии с инструкциями производителей наборов реагентов/тест-систем и оборудования (список исследуемых аллергенов представлен в приложениях 4, 5 к настоящим МР).

Таблица 3.4

Интерпретация результатов содержания IgE в сыворотке крови

3.6. Метод иммуноблоттинга и ИФА (технология Protia Allergy-Q).

3.6.1. Технология Protia Allergy-Q сочетает в себе метод ИФА и иммуноблоттинг (иммуноблот) - выявления антител к отдельным антигенам, основанная на постановке ИФА на нитроцеллюлозных мембранах.

3.6.2. Биоматериал: сыворотка венозной крови.

3.6.3. Список исследуемых аллергенов представлен в приложении 4 к настоящим МР.

3.6.4. Оборудование и материалы, необходимые при работе.

3.6.4.1. Для ручной постановки:

1) оборудование <35>:

--------------------------------

<35> Примечание: допускается использование оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

- орбитальное качающее устройство или качающее устройство (например, КУ-400);

- анализатор иммунологический фотометрический "Q-SMART" для диагностики in vitro на панелях PROTIA Allergy-Q, позволяющий производить измерение оптической плотности в лунках планшета при длине волны 450 нм (основная) и 620 нм (референсная);

- аспиратор вакуумный;

- пипетки автоматические одноканальные со сменными наконечниками, позволяющие отбирать объемы жидкостей от 0,01 мл до 5,0 мл, аттестованные по значению средней дозы и сходимости результатов пипетирования (погрешность не более 3%);

- цилиндры мерные вместимостью 10 мл и 200 мл, ГОСТ 1770-74;

- стаканы мерные вместимостью 10 мл и 200 мл.

2) расходные материалы <36>:

--------------------------------

<36> Примечание: допускается использование расходных материалов с аналогичными или лучшими характеристиками.

- пинцет пластмассовый;

- перчатки резиновые;

- вода дистиллированная, ГОСТ 58144-2018;

- контейнер для сбора твердых отходов;

- контейнер для слива отработанных жидкостей;

- флаконы стеклянные вместимостью 20 мл;

- бумага фильтровальная, ГОСТ 12026-76;

- одноразовая посуда для приготовления рабочих растворов конъюгата и хромогена.

3) Набор реагентов Protia Allergy-Q <37>.

--------------------------------

<37> Примечание: допускается использование других реагентов с аналогичными характеристиками.

Состав набора Protia Allergy-Q:

- панель для аллергенов;

- разбавитель образца;

- раствор антител;

- ферментный раствор;

- раствор субстрата;

- моющий раствор;

- инструкция по применению.

3.6.4.2. Для автоматической постановки:

1) оборудование <38>:

--------------------------------

<38> Примечание: допускается использование оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

- прибор для автоматизации иммуноблота;

- анализатор автоматический иммунологический фотометрический "Q-Station Elite" для диагностики in vitro на панелях "Protia", позволяющий производить измерение оптической плотности в лунках планшета при длине волны 450 нм (основная) и 620 нм (референсная);

- аспиратор вакуумный;

- холодильник бытовой;

- дозаторы полуавтоматические одноканальные с переменным или фиксированным объемом со сменными наконечниками, позволяющие отбирать объемы жидкости от 5 до 1000 мкл;

- цилиндр мерный вместимостью 1000 мл, ГОСТ 1770-74.

2) расходные материалы <39>:

--------------------------------

<39> Примечание: допускается использование расходных материалов с аналогичными или лучшими характеристиками.

- перчатки резиновые;

- вода дистиллированная, ГОСТ 58144-2018;

- дезинфицирующие средства.

3) Набор реагентов Protia Allergy-Q <40>.

--------------------------------

<40> Примечание: допускается использование других реагентов с аналогичными характеристиками.

Состав набора Protia Allergy-Q см. в п. 3.6.4.1.

3.6.5. Методика:

- метод ИФА, включающий себя одну нитроцеллюлозную мембрану;

- подготовка нитроцеллюлозной мембраны с аллергенами;

- внесение сыворотки больного (специфические АТ связываются с соответствующими АГ);

- добавление АТ против иммуноглобулинов человека, меченных ферментом;

- добавление субстрата и учет реакции.

3.6.6. Интерпретация результатов определения уровня содержания специфических IgE (табл. 3.5) проводится с учетом методики, в соответствии с инструкциями производителей наборов реагентов/тест-систем и оборудования (список исследуемых аллергенов представлен в приложениях 4, 5 к настоящим МР).

Таблица 3.5

Интерпретация результатов содержания IgE в сыворотке крови