2.3 Лабораторные диагностические исследования

- Всем пациентам с подозрением на НС в целях дифференциации и подтверждения диагноза рекомендовано выполнение общего (клинического) анализа крови развернутого (на автоматическом гематологическом анализаторе), определение уровня ретикулоцитов в крови [1 - 6, 31].

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 5)

Комментарии: у пациентов с НС обычно наблюдается нормальное среднее содержание гемоглобина в эритроците (МСН), нормальный, значительно реже сниженный, средний объем эритроцитов (MCV), повышение средней концентрации гемоглобина в эритроците (МСНС). В мазке крови обнаруживаются микроцитоз, гиперхромия, анизоцитоз, пойкилоцитоз, наличие сфероцитов. После спленэктомии встречаются тельца Жолли и кольца Кебота в эритроцитах. При НС всегда присутствует ретикулоцитоз, абсолютное число ретикулоцитов (Ret) 80 x 10⁹/л и более, соотношение числа ретикулоцитов (Ret) к числу незрелых ретикулоцитов (IRF) более 7,7 (Ret/IRF > 7.7) [15]. НС считается легкой степени тяжести при Hb > 120 г/л и Ret/IRF > 19, средней степени тяжести - Hb 80 - 120 г/л, относительном числе микроцитов (микроформ эритроцитов) (MicroR) > 3,5% и соотношении MicroR к относительному количеству гипохромных эритроцитов (Hypo-He) (MicroR/Hypo-He) > 2,5%, тяжелой степени --Hb < 80 г/л, MicroR > 3,5% и MicroR/Hypo-He > 2,0%.

- Всем пациентам с подозрением на НС в целях дифференциальной диагностики и подтверждения диагноза рекомендовано выполнение просмотра мазка крови для анализа аномалий морфологии эритроцитов, тромбоцитов и лейкоцитов (микроскопия мазка крови) с морфологической оценкой эритроцитов (средний диаметр эритроцитов, индекс сферичности (норма > 3,5), индекса овалоцитоза (норма > 0,85), % содержания морфологических форм эритроцитов) с построением кривой Прайс-Джонса [1 - 6, 31].

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 5)

- Всем пациентам с подозрением на НС и с диагностированным НС рекомендовано исследование анализа крови биохимического общетерапевтического (исследование уровня общего билирубина в крови, исследование уровня свободного и связанного билирубина в крови, определение активности лактатдегидрогеназы в крови, определение активности аспартатаминотрансферазы в крови, определение активности аланинаминотрансферазы в крови, определение активности щелочной фосфатазы в крови) для оценки интенсивности гемолиза, диагностики холестаза, а также в рамках дифференциальной диагностики желтухи [1 - 6, 31 - 34, 38, 39].

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 5)

- Всем пациентам с подозрением на НС в целях дифференциальной диагностики и подтверждения диагноза рекомендовано исследование осмотической резистентности эритроцитов (ОРЭ) до и после инкубации [1 - 6, 31].

Комментарий: нормальная ОРЭ не исключает диагноз НС и может встречаться в 10 - 20% случаев НС. ОРЭ может также быть нормальной при сочетании с дефицитом железа, обтурационной желтухой, в фазе восстановления после апластического криза, когда количество ретикулоцитов увеличено. Обезвоживание клеток, происходящее в сфероцитах, при НС может быть одной из причин нормальной ОРЭ у пациентов с неудаленной селезенкой. Нормальные значения ОРЭ могут наблюдаться у пациентов с наследственным овалоцитозом и гемолизом или у пациентов с аутоиммунной гемолитической анемией.

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 5)

- Всем пациентам с подозрением на НС в целях дифференциальной диагностики и подтверждения диагноза рекомендовано проведение ЭМА-теста (тест с флюоресцентным красителем эозин-5-малеимид) [1 - 6, 7 - 17, 31].

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 5)

Комментарий: ЭМА-тест более информативен для постановки диагноза НС, так как реже дает ложноположительный результат. Однако, он неспецифичен, и может выявлять эритроциты с редкими мембранными расстройствами, такими как аномалии белка полосы 3 (например, врожденная дизэритропоэтическая анемия 2 типа (CDAII), наследственный овалоцитоз Юго-Восточной Азии (SAO)), изменения во внутриклеточной вязкости (например, серповидные эритроциты), термочувствительный транспорт одновалентных катионов (например, криогидроцитоз). В мягких или нетипичных случаях, трудности интерпретации, вероятно, будут в тех случаях, когда результат попадает в интервал между нормальными и типичными для НС значениями. ЭМА-тест методом проточной цитометрии может помочь дифференцировать наследственный пиропойкилоцитоз (HPP) с MCV < 60 фл и наследственный овалоцитоз от НС, основываясь на классификации сокращения (степени снижения) интенсивности флюоресценции: для НРР (самое низкое) < НС < овалоцитоз < нормальный контроль. Хотя аналогичные показатели флуоресценции эритроцитов при НС получаются при других редких аномалиях эритроцитов - CDAII, SAO и криогидроцитоз - их можно отличить на основе их различных клинических особенностей (Приложения А3.3, А3.4). В части случаев аутоиммунной гемолитической анемии с тепловыми агглютининами за счет присоединения антител (класса IgG) к внеклеточным фрагментам белка полосы 3 ЭМА-тест может быть снижен. Другие нетипичные случаи НС могут давать аномальные гистограммы, которые определяются путем наложения нормальных и контрольных (при типичном НС) гистограмм. Нормальные результаты флуоресценции получаются у пациентов с ретикулоцитозом или аутоиммунной гемолитической анемией с холодовыми агглютининами.

В качестве дополнительного теста для диагностики НС используется исследование фильтруемости эритроцитов [17]. Исследование фильтруемости эритроцитов показало высокую чувствительность, а также максимальную специфичность при дифференциальной диагностике НС и других гемолитических анемий, в первую очередь, дефицита пируваткиназы [17]. Для НС характерны значения фильтруемости эритроцитов равные 0 - 0,31 ед.

Выбирая необходимый лабораторный тест для диагностики легкой или нетипичной формы заболевания, необходимо учитывать чувствительность и специфичность теста, сложность его проведения и общую стоимость исследования. Поскольку НС связан со структурным дефектом цитоскелета мембраны эритроцита, результат исследований должен определить связан дефект эритроцита с мембраной или нет.

Идентификация молекулярно-генетического дефекта подтверждает диагноз НС, но не является необходимым для диагностики в большинстве случаев, так как точный диагноз может быть поставлен на основе эритроцитарных индексов, клинических данных, семейного анамнеза и положительного результата стандартных тестов. Однако, необходима в тех случаях, когда клиническое состояние пациента не соответствует степени тяжести НС, имеющегося у других членов семьи.

- Пациентам с НС, зависимым от трансфузий эритроцитсодержащих компонентов крови, рекомендуется исследование параметров метаболизма железа (исследование уровня ферритина в крови, исследование уровня трансферрина сыворотки крови, исследование железосвязывающей способности сыворотки (ОЖСС), исследование уровня железа сыворотки крови и исследование насыщения трансферрина железом (НТЖ)) в целях диагностики вторичного гемохроматоза [19 - 22].

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 5)

- Всем пациентам с НС рекомендуется подтверждение диагноза молекулярно-генетическими методами (секвенирование следующего поколения, NGS) [18].

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 5)

Комментарий: выполнение молекулярно-генетического исследования имеет определяющее значение для верификации диагноза в случае неоднозначности результатов лабораторных тестов, а также в следующих ситуациях:

- клинически фенотип более тяжелый, чем предполагаемый по данным морфологии эритроцитов;

- особенности морфологии эритроцитов у ребенка, не соответствующие диагнозу НС, в случае если родитель болен НС;

- диагноз не ясен до спленэктомии.

- Всем пациентам с НС при развитии апластического криза рекомендуется определение ДНК парвовируса B19 (Parvovirus B19) в пунктате костного мозга, количественное исследование (А26.30.012.002) и/или определение антител класса M (IgM) к парвовирусу B19 (Parvovirus B19) в крови с целью диагностики парциальной красноклеточной аплазии, ассоциированной с парвовирусом B19 [1 - 2].

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 5)

Комментарий: у пациентов с НС апластические кризы обусловлены транзиторной красноклеточной аплазией (ТКА), развившейся вследствие инфицирования парвовирусом B19 (парвовирус B19 также вызывает развитие erythema infectiosum известную как "пятая болезнь") [1, 2]. Аплазия является результатом прямого цитотоксического действия парвовируса B19 на эритроидные предшественники, в какой-то степени могут повреждаться и предшественники других клеточных линий. Пациенты могут иметь возрастающую головную боль, слабость, диспноэ, более тяжелую чем обычно анемию и глубокое снижение числа ретикулоцитов (обычно менее 1% или 10 x 10⁹/л). Также может быть лихорадка, признаки инфекции верхних дыхательных путей и/или гастроинтестинальные симптомы. Кожные высыпания не имеют специфических характеристик. Ретикулоцитопения появляется примерно на 5 день заражения и продолжается в течение 5 - 10 дней. Утяжеление анемии происходит вскоре после ретикулоцитопении, Hb снижается до 39 г/л. Первый признак начала выздоровления от инфекции - высокий ретикулоцитоз, что при сохранении глубокой анемии иногда ошибочно трактуется как синдром гипергемолиза. Выздоровление как правило сопровождается появлением в периферической крови большого числа нормобластов (более 100 на 100 лейкоцитов). Диагноз ТКА подтверждается повышенным содержанием IgM к парвовирусу B19 в крови. При выздоровлении от парвовирусной B19 инфекции появляется защитный титр IgG, что препятствует повторному заболеванию этой инфекцией в течение всей жизни пациентов. Контролируемых исследований по терапии ТКА не проводилось. Большая часть пациентов выздоравливают самостоятельно [1, 2].

Хотя большинство взрослых приобрели иммунитет к парвовирусу B19, работники больницы, которые восприимчивы и имеют контакт с больными ТКА подвергаются высокому риску внутрибольничного заражения инфекционной эритемой (erythema infectiosum). Перенесенная во втором триместре беременности инфекция может привести к водянке плода и мертворождению, поэтому необходимы изоляционные меры предосторожности для персонала в случае беременности.

Таблица 2. Диагностические критерии НС.