IV. Оценка местного действия химического соединения на кожу

4.1. Исследования проводят в острых (однократных) опытах. В качестве подопытных животных используются морские свинки (300 - 350 г), кролики (2,0 - 3,0 кг). Для изучения местного действия в острых опытах используются кролики породы "Шиншилла", морские свинки - светлой масти. Использование животных других видов возможно при предоставлении достаточного обоснования. Количество животных в группе составляет не менее 10 особей для морских свинок и не менее 3 животных для кроликов.

На кожу первоначально наносится 20 мг/см² соединения. Реакция кожи регистрируется по окончании экспозиции, через 1 и 24, 72 часа и 14 дней после однократной аппликации.

Продолжительность периода наблюдений выбирают таким образом, чтобы в полной мере можно было оценить обратимость наблюдаемых эффектов. Однако эксперимент прекращается, если у животного наблюдаются продолжительные признаки сильной боли или дистресса. Для определения обратимости реакций животные находятся под наблюдением в течение 14 дней после удаления пробы. Эксперимент целесообразно закончить досрочно в случае наблюдения обратимости реакций до окончания 14 дней наблюдений.

4.2. Функциональные нарушения кожи характеризуются появлением различной степени выраженности эритемы, отека, трещин, изъязвлений, изменением температуры и скорости проницаемости эпидермиса, снижением сопротивления кожи постоянному электрическому току, уменьшением ее нейтрализующей способности. Оценку воздействия изучаемого соединения на кожный покров рекомендуется проводить по критериям, приведенным в таблицах 3 - 5 <6>.

--------------------------------

<6> Методические указания к постановке исследований по изучению раздражающих свойств и обоснованию предельно допустимых концентраций избирательно действующих раздражающих веществ в воздухе рабочей зоны, утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 11.08.1980 N 2196-80 (далее - МУ N 2196-80).

Оценка степени эритемы (таблица 3) и отека (таблица 4) суммируются для каждого подопытного животного, после чего вычисляется средняя оценка выраженности раздражающего свойства соединения для группы экспериментальных животных, позволяющая проводить межгрупповое сравнение (таблица 5).

Таблица 3

Оценка степени эритемы

Таблица 4

Оценка отека кожи животных

--------------------------------

<7> ГОСТ 6507-90 "Микрометры. Технические условия", введенный постановлением Госстандарта СССР от 25.01.1990 N 86.

Таблица 5

Классификация раздражающего действия

4.3. Раздражающее действие оценивается с учетом тяжести поражения и обратимости. Обратимость кожных поражений рассматривается, исходя из оценки реакции раздражения. Если реакции кожи, такие как алопеция, гиперкератоз, гиперплазия и шелушение, сохраняются до конца 14-дневного срока наблюдения, исследуемое соединение признают раздражающим. Реакция кожи, проходящая до 14 дней, оценивается в соответствии с классификацией (таблица 5).

4.4. При необходимости, для соединений, относящихся к 1 - 4 классам по степени выраженности раздражающего действия на кожу, целесообразно устанавливать величину минимального разбавления, вызывающего раздражающий эффект у 50% животных (порог однократного действия соединения), и минимального разбавления, не вызывающего раздражения кожи.

4.5. Для соединений, относящихся к 5 - 10 классам по степени выраженности раздражающего действия на кожу, изучение кожно-резорбтивного действия не проводят в связи с тем, что в дополнении к высокому групповому показателю эритемы и отека (более 6,1 балла), неразбавленное соединение, или его растворы (содержание от 50% до менее 5%) способны вызывать некроз.

4.6. Для соединений, относящихся к 4 - 10 классам по раздражающему действию на кожу, ставится пометка "местное действие" (м. д.), т.е. опасны при попадании на кожу и слизистые оболочки глаз.

4.7. Оценка сенсибилизирующего действия химического соединения на кожу.

4.7.1. Кожная сенсибилизация изучается путем подкожной инъекции и (или) накожного нанесения соединения. Используют не менее 10 опытных и 5 контрольных морских свинок.

4.7.2. Оптимальным является использование максимизационного теста или теста Бюхлера, при которых провокационная проба наносится на участок кожи, противоположный боку, на котором проводили индукционные аппликации. Кожная реакция оценивается в соответствии с классификацией по шкале Магнуссона-Клигмана <8> (таблица 6).

--------------------------------

<8> Приложение 6.5 Р 1.2.3156-13 "Оценка токсичности и опасности химических веществ и их смесей для здоровья человека", утвержденного врио руководителя Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главного государственного санитарного врача Российской Федерации 27.12.2013.

Таблица 6

Классификация кожной реакции при оценке

4.7.3. Максимизационный тест на морских свинках проводится следующим образом. Рекомендуется, чтобы группа, подвергающаяся воздействию, содержала не менее 20 животных, контрольная группа - не менее 10.

Концентрация исследуемого соединения для индукционной экспозиции выбирается таким образом, чтобы она была хорошо физиологически переносима и вызывала легкое или умеренное раздражение кожи. Концентрация в провокационной экспозиции подбирается таким образом, чтобы она не вызывала раздражение. Подходящие концентрации определяются в предварительном испытании на 2 - 3 животных, если другая информация отсутствует. Для этой цели предпочтение отдается ПАФ-обработанным (полный адьювант Фрейнда) животным.

Индукционная экспозиция: подкожные инъекции.

День 0 - исследуемая группа. Три пары подкожных инъекций объемом 0,1 мл вводятся в плечевую область, очищенную от шерсти таким образом, чтобы инъекции были по обе стороны срединной линии: инъекция 1 - смесь 1:1 (по объему) ПАФ/вода или физиологический раствор; инъекция 2 - исследуемое соединение в подходящем растворителе в выбранной концентрации; инъекция 3 - исследуемое соединение в выбранной концентрации в смеси 1:1 (по объему) ПАФ/вода или физиологический раствор.

В инъекции 3 растворимые в воде соединения до смешивания с ПАФ растворяются в воде. Жирорастворимые или нерастворимые соединения до перемешивания с водой растворяются в ПАФ. Конечная концентрация исследуемого соединения равняется концентрации в инъекции 2.

Инъекции 1 и 2 вводятся близко друг другу и к голове животного, в то время как инъекция 3 вводится ближе к хвостовой части тестовой области.

День 0 - контрольная группа. Три пары подкожных инъекций объемом 0,1 мл вводятся в одно и то же место животным, не подвергшимся обработке: инъекция 1 - смесь 1:1 (по объему) ПАФ/вода или физиологический раствор; инъекция 2 - неразбавленный растворитель; инъекция 3 - 50% растворителя в смеси 1:1 (по объему) ПАФ/вода или физиологический раствор.

Индукционная экспозиция: местное нанесение.

День 5 - 7 - тестовая и контрольная группы. За 24 часа до нанесения соединения, если соединение не является раздражающим для кожи, тестовая область после стрижки или бритья обрабатывается 0,5 мл 50% лаурилсульфатом натрия в вазелине для того, чтобы вызвать местное раздражение.

День 6 - 8 - тестовая группа. С тестовой области снова удаляется шерсть. Фильтровальная бумага (2 x 4 см) полностью заполняется исследуемым соединением в подходящем растворителе (с приведением обоснования выбора растворителя) и накладывается на тестовую область под герметичную повязку на 48 часов. Твердые соединения измельчаются и помещаются в подходящий растворитель. Жидкости допускается наносить неразбавленными.

День 6 - 8 - контрольная группа. С тестовой области снова удаляют шерсть. На тестовую область наносится только растворитель. Фильтровальная бумага (2 x 4 см) полностью заполняется исследуемым растворителем в количестве, равном тому, что наносится в тестовой группе, и накладывается на тестовую область под герметичную повязку на 48 часов.

Провокационная экспозиция: местное нанесение.

День 20 - 22 - тестовая и контрольная группы. С боков тестовых и контрольных животных удаляется шерсть. Пластырь, заполненный тестовым соединением, накладывается на один бок животного. Допускается накладывать пластырь, заполненный растворителем, на другой бок того же животного. Пластырь удерживается на коже под герметичной повязкой в течение 24 часов.

Наблюдения: тестовая и контрольная группы. Через 21 час после удаления пластыря контрольная область очищается, шерсть коротко остригается, бреется или депилируется. Через 3 часа (через 48 часов с начала контрольного нанесения) наблюдается кожная реакция и регистрируется в соответствии с классификацией (таблица 6).

Через 24 часа после данного наблюдения (72 часа) проводится второе наблюдение, и снова регистрируется реакция.

4.7.4. Тест Бюхлера проводится следующим образом. В тестовой группе рекомендуется использовать не менее 20 животных, в контрольной - 10.

Концентрации исследуемого соединения для каждой индукционной экспозиции подбираются таким образом, чтобы она была максимально возможной (при слабом раздражающем действии). Концентрация, используемая в провокационной экспозиции, подбирается таким образом, чтобы она была максимальной, не вызывающей раздражение. Подходящие концентрации определяют в предварительном тесте с использованием 2 - 3 животных, если другая информация отсутствует.

Для растворимых соединений рекомендуется использовать воду или не вызывающий раздражение раствор поверхностно-активных веществ (ПАВ) в качестве растворителя. Для других исследуемых соединений используется 80% смесь этанола/воды, подходящая для индукционной экспозиции, ацетон - для провокационной пробы.

Индукционная экспозиция: местное нанесение.

День 0 (до экспозиции) - тестовая группа. С одного бока животного удаляется (коротко остригается) шерсть. Тестовый пластырь полностью заполняется исследуемым соединением в подходящем растворителе (жидкие исследуемые соединения допускается наносить не разбавленными). Исследуемое соединение накладывается на тестовую область и удерживается на коже под герметичной повязкой или пластырем в течение 6 часов.

Обеспечивают герметичность тестовой системы. Подходит ватный диск, круглый или квадратный, размером примерно 4 - 6 см. Для гарантии герметичности предпочтительно использовать фиксацию подходящей повязкой.

День 0 (до экспозиции) - контрольная группа. На одном боку животного удаляется (коротко остригается) шерсть. На кожу тем же путем, что и для тестовой группы, наносится только растворитель. Тестовая система удерживается на коже герметичным пластырем или подходящей повязкой в течение 6 часов.

День 6 - 8 и 13 - 15 - тестовая и контрольная группы. На 6 - 8, а потом на 13 - 15 дни та же тестовая область того же бока животного (шерсть удаляют, если необходимо) обрабатывается тем же способом, что и в 0 день.

Провокационная экспозиция.

День 27 - 29 - тестовая и контрольная группы. С необработанного бока животных тестовой и контрольной групп удаляется (коротко остригается) шерсть. На заднюю часть остриженного бока животных тестовой и контрольной групп накладывается повязка, содержащая необходимое количество исследуемого соединения в максимально возможной концентрации, не вызывающей раздражение. Если необходимо, то повязку или пластырь с растворителем также накладывают на переднюю часть бока животных тестовой и контрольной групп. Пластырь удерживают герметичной повязкой на коже в течение 6 часов.

Наблюдения: тестовая и контрольная группы. Через 21 час после удаления пластыря с контрольной области удаляется шерсть.

Через 3 часа (через 30 часов после наложения контрольного пластыря) наблюдаются кожные реакции и регистрируются в соответствии с классификацией, приведенной для максимизационного теста (см. п. 4.7.2, таблицу 6).

Через 24 часа после осмотра (через 54 часа после наложения контрольного пластыря) кожные реакции вновь наблюдаются и регистрируются.

4.7.5. При необходимости, для получения информации о сенсибилизации, можно применять другие методы <9>. Так, при изучении простых химических соединений рекомендуется применение метода сенсибилизации морских свинок внутрикожно в зону уха и (или) воспроизведение гиперчувствительности замедленного типа (далее - ГЗТ) на мышах.

--------------------------------

<9> МУ 1.1.578-96 "Требования к постановке экспериментальных исследований по обоснованию предельно допустимых концентраций промышленных химических аллергенов в воздухе рабочей зоны и атмосферы", утвержденные Первым заместителем Председателя Госкомсанэпиднадзора, заместителем Главного государственного санитарного врача 21.10.1996.

При изучении сложных по составу соединений целесообразно осуществлять комбинированную сенсибилизацию морских свинок (в кожу уха и дополнительно на кожу). Так же могут быть использованы и другие способы сенсибилизации животных. Например, при исследовании химических соединений, особенно пастообразных и вязких, загрязняющих кожные покровы рабочих, целесообразна проверка возможности развития контактной аллергии методом многократных накожных аппликаций на морских свинках.

Для оценки иммунологической реактивности в крови у морских свинок через 48 часов после провокационной пробы проводится определение реакции специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ), лейкоцитарной формулы крови. Кожную сенсибилизацию позволительно оценивать по реакции региональных лимфатических узлов в сочетании с другими методами.