5.1. Ориентировочная оценка кожно-резорбтивного действия. Ориентировочная оценка кожно-резорбтивного действия может осуществляться "пробирочным методом" и нанесением соединения на кожу спины лабораторного животного.

5.1.1. Для того, чтобы установить возможность развития интоксикации при однократном воздействии, погружают хвосты мышей или крыс в исследуемый продукт в пробирке ("пробирочный" метод) на 2 часа (мыши) или на 4 часа (крысы), так как это дает возможность оценить воздействие на кожу максимально возможных количеств соединения. Принимают меры для исключения попадания паров соединения из пробирки в дыхательные пути животного, например, путем герметизации пробирки с соединением.

5.1.2. Нанесение соединения на кожу спины начинается с 20 мг/см² (максимально наносимое количество соединения на кожу кроликов) при отсутствии местного раздражающего действия (класс 0). Для соединений 1 - 4 классов используется минимальное разбавление соединения, не вызывающее раздражающего эффекта в острых опытах. Соединения, имеющие экстремальные значения pH менее 2.0 и более 11.5 (щелочи и кислоты) наносятся только в разведении, не вызывающем раздражающего эффекта.

5.1.3. Для установления видовой чувствительности рекомендуется использовать не менее 2 видов лабораторных животных (самки крысы обязательны).

5.1.4. Учет реакции ведется по гибели животных или по развитию клинических признаков интоксикации.

5.1.5. В случаях отсутствия клинических признаков воздействия после однократной аппликации изучение кожной резорбции проводится в подостром эксперименте (20 аппликаций) в течение 4 недель по 5 раз в неделю.

5.1.6. Изучение состояния подопытных животных проводится через 5, 10, 20 аппликаций с привлечением интегральных и специфических показателей. Целесообразно использовать показатели, оказавшиеся чувствительными при ингаляционном и пероральном путях поступления <10>. При необходимости допустимо проводить определение исследуемого соединения и его метаболитов в биосредах (кровь, моча) при помощи поверенных автоматических анализаторов. Один из интегральных показателей, рекомендуемых к исследованию - вес тела, который измеряют у всех животных один раз в неделю при помощи поверенных прецизионных весов с функцией взвешивания нестабильных грузов.

--------------------------------

<10> Методические указания к постановке исследований для обоснования санитарных стандартов вредных веществ в воздухе рабочей зоны, утвержденные Главным государственным санитарным врачом СССР 04.04.1980 N 2163-80.

5.1.7. Если на данном этапе не выявлено резорбтивного действия соединения, дальнейшие исследования по изучению кожного воздействия прекращаются.

5.1.8. Если при воздействии самой высокой возможной дозы (2500 мг/кг) смертельный исход маловероятен, проводится исследование по определению пороговой дозы. Порогом вредного действия соединения (острого и хронического) называется <11> минимальная доза нанесенного на кожу соединения, которая вызвала в адекватной статистической группе животных изменения, выходящие за пределы физиологических приспособительных реакций, или возникновение скрытой (временно компенсированной) патологии. Порог вредного действия характеризуется следующими признаками:

--------------------------------

<11> МУ N 2196-80.

а) изменения достоверно (p 0,05) отличаются от контроля и выходят за пределы физиологических колебаний показателя для данного вида животных и данного времени года;

б) достоверных (p 0,05) изменений по сравнению с контролем нет, но наблюдаются скрытые нарушения равновесия с внешней средой, выявляемые, в частности, при помощи функциональных нагрузок;

в) изменения достоверно (p 0,05) отличаются от контроля, находятся в пределах физиологической нормы, однако стойко сохраняются в хроническом эксперименте на животных (более 1 месяца);

г) проведение параллелей между результатами биохимических, физиологических и морфологических исследований. Если функциональные изменения выходят за пределы гомеостатических колебаний и сопровождаются изменениями структуры тканей и органов, то найденные сдвиги следует рассматривать как патологические, вредные для организма. Если обнаруженные функциональные изменения прогрессируют во времени и тем более, если они не исчезают в восстановительный период, тогда они расцениваются как вредные, патологические.

5.1.9. В случае гибели животных при однократном воздействии или при наличии изменений показателей, используемых в подостром эксперименте, выходящих за порог вредного действия, к ПДК соединения в воздухе рабочей зоны вносится пометка "+" - соединение, при работе с которым требуется специальная защита кожи и глаз". Для указанной группы соединений устанавливаются ПДУ загрязнения кожи. С этой целью приступают к следующему этапу исследований - количественной оценке кожно-резорбтивного поступления вредных химических соединений в организм.

5.2. Количественная оценка кожно-резорбтивного поступления вредных химических соединений в организм при однократном воздействии.

5.2.1. Установление LD₅₀^cut и TL₅₀^cut.

Для выбора начальных доз с целью определения LD₅₀ используют уравнения, учитывающие корреляционную связь между параметрами токсичности органических соединений при различных путях (формулы 3 - 5):

; (3)

; (4)

(5)

Расчетные значения TL₅₀ могут быть получены из формулы (6):

(6)

Наиболее часто определяется зависимость между LD₅₀^cut и TL₅₀^cut, представленная в таблице 7.

Таблица 7

Зависимость среднесмертельной дозы от среднеэффективного

времени гибели животных

5.2.2. Кроме смертельных эффектов учитываются клинические признаки интоксикации, время их появления, выраженность и другие объективные показатели, аналогичные проявлениям при других путях воздействия соединений (изменение массы тела, поведенческие реакции, биохимические, гематологические показатели).

5.2.3. Расчет LD₅₀ проводится в мг/кг, а также в мг/см², методом пробит-анализа.

5.2.4. Степень опасности химического соединения при кожном пути поступления по величинам LD₅₀^cut устанавливается в соответствии со следующими диапазонами (таблица 8).

Таблица 8

Классификация кожно-резорбтивного действия по LD₅₀^cut

5.2.5. Определение порога Lim_ac^cut острого действия. В эксперименте для определения Lim_ac^cut исследуют не менее 3 уровней. Разрыв между ними определяет степень токсичности соединения и его кумулятивные свойства. Выбор показателей для определения воздействия соединения проводится с учетом изменений, выявленных при ингаляционном и других путях поступления соединения. Порог вредного действия устанавливается по интегральным и специфическим показателям.

5.2.6. Зона острого действия (Z_ac^cut) при дермальном поступлении вычисляется по отношению средней смертельной концентрации (дозы) к пороговой концентрации (дозе) при однократном воздействии по формуле (7):

, (7)

где: LD₅₀^cut - средняя смертельная концентрация (доза) при однократном накожном нанесении в мг/кг;

Lim_ac^cut - пороговая концентрация (доза) при однократном накожном нанесении в мг/кг.

5.3. Исследование кумулятивных свойств.

5.3.1. В качестве подопытных животных используются белые крысы с исходной массой 200 - 220 г. Количество животных в группе не менее 10 особей. Изучение кумуляции соединения проводится при 20 кратном нанесении на кожу 1/5, 1/10, или 1/20 LD₅₀^cut в течение месяца. Дозу, вводимую животным, выбирают экспериментально исходя из LD₅₀^cut, установленной в однократном опыте.

5.3.2. В качестве показателя кумулятивного действия соединения при поступлении его через кожу позволительно использовать дозы, вызывающие не только гибель (ее может не быть), а и небольшие, но статистически достоверные сдвиги каких-либо чувствительных показателей (пороговые дозы), а также промежуток времени, в течение которого развился определенный объективно регистрируемый эффект (ET₅₀).

5.3.3. В случае, когда животные погибают, кумулятивные свойства соединения характеризуются коэффициентом кумуляции: отношением LD₅₀^cut при многократном нанесении к LD₅₀^cut при однократной аппликации на кожу по формуле (8):

, (8)

где: - средняя смертельная концентрация (доза) при многократном накожном нанесении в мг/кг;

LD₅₀^cut - средняя смертельная концентрация (доза) при однократном накожном нанесении в мг/кг.

5.4. Определение порога Lim_ch хронического действия.

5.4.1. Опыты проводятся на белых крысах по 4 часа в день 5 раз в неделю на протяжении 4 месяцев.

5.4.2. Выбор уровней воздействия основывается на знании свойств соединения (например, быстрое обезвреживание, метаболизирование, способность к кумуляции). Исследования проводятся на двух - трех уровнях воздействия ниже Lim_ac^cut.

5.4.3. Рекомендуется, чтобы самый высокий уровень дозы вызывал токсический эффект, без смертельного исхода, самый низкий уровень дозы не вызывал никаких признаков интоксикации.

Для изучения проявлений воздействия применяется комплекс функциональных, биохимических и морфологических показателей, связанных с характером биологического действия соединения. Исследования проводятся с использованием методов и методик, применяемых для оценки токсических свойств соединений при пероральном поступлении. Наряду с применением интегральных и специфических показателей, характеризующих действие вредного соединения на организм, проводится изучение скорости всасывания соединения через кожу, кинетики и метаболизма его в организме.

5.4.4. Исследование состояния животного проводят в динамике. В течение всего эксперимента наблюдают за состоянием животных, еженедельно взвешивают, ежемесячно проводят клинические биохимические анализы, регистрируются изменение поведенческих реакций и т.д.

После окончания эксперимента половина животных в каждой группе умерщвляется, вторая половина оставляется на 28 дней после эксперимента, для выявления способности к восстановлению или необратимости токсических эффектов.

Все животные в исследовании подвергаются макроскопической аутопсии. Рекомендуется все макроскопические поражения, кожу, органы-мишени подвергать гистологическому изучению.

5.4.5. Зона хронического действия вычисляется по отношению пороговой концентрации (дозы) при однократном воздействии к пороговой концентрации (дозе) при хроническом воздействии по формуле (9):

, (9)

где: Lim_ac^cut - пороговая концентрация (доза) при однократном накожном нанесении в мг/кг;

Lim_ch^cut - пороговая концентрация (доза) при хроническом накожном воздействии в мг/кг;

5.5. Обоснование ПДУ загрязнения кожи.

5.5.1. ПДУ загрязнений кожных покровов в мг/см² рассчитывается с учетом величины экспериментального порога хронического действия и коэффициента запаса (от 3 до 20).

5.5.2. Обоснование коэффициента запаса производится с учетом:

- среднесмертельной дермальной дозы LD₅₀^cut;

- времени контакта с кожей, приводящей к 50% гибели TL₅₀^cut;

- порога (Lim_ac^cut) и зоны (Lim_ac^cut) острого действия;

- коэффициента кумуляции K_cum^cut;

- порога (Lim_ch^cut) и зоны (Lim_ch^cut) хронического действия.

5.5.3. Коэффициент запаса возрастает:

- с увеличением абсолютной токсичности;

- с уменьшением величины TL₅₀ и увеличением скорости всасывания соединения через кожу;

- с уменьшением зоны острого действия;

- с увеличением кумулятивных свойств соединения;

- с увеличением зоны хронического действия.

5.5.4. При наличии сенсибилизирующего, канцерогенного и других проявлений отдаленных последствий действия соединения обосновывается установление коэффициента запаса, превышающего 20. Решение в каждом конкретном случае зависит от особенностей действия соединения, от адекватности и чувствительности показателей, избранных для определения минимально действующей дозы. В обычных случаях коэффициент запаса находится в диапазоне от 3 до 20.

5.5.5. Определение величины ПДУ проводится путем пересчета дозы соединения (мг/кг) в плотность загрязнения кожных покровов (мг/см²) по формуле (10):

ПДУ = Lim_ch^cut x M : Кз x S, мг/см², (10)

где: Lim_ch^cut - пороговая доза, установленная экспериментально в хроническом эксперименте с учетом определения остаточного количества соединения на коже (п. 3.8);

M - масса тела человека, в среднем принята за 70 кг;

Кз - коэффициент запаса (п.п. 5.5.2 - 5.5.4);

S - площадь кожного покрова человека, в среднем равна 16120 см².

5.6. Обоснование ОДУ загрязнения кожных покровов.

5.6.1. Для оперативной оценки риска кожно-резорбтивного действия соединений допустим расчет ОДУ загрязнения кожных покровов.

5.6.2. Расчет ОДУ (мг/см²) проводится с применением величины Lim_ch^cut (мг/кг), экспериментальной или рассчитанной на основе показателя острой дермальной токсичности - LD₅₀^cut (мг/кг) соединения, по формуле (11):

ОДУ = (Lim_ch^cut x M x Кост x Котн.прон.) :

: S x Кз, мг/см², (11)

где: Lim_ch^cut - пороговая доза, установленная экспериментально в хроническом опыте или рассчитанная на основании LD₅₀^cut в мг/кг;

M - масса тела человека, в среднем принята за 70 кг;

К_ост. - коэффициент остаточный, выражающий экспозиционное соотношение количества соединения, оставшегося на коже после определенного времени, и первоначально нанесенное, в среднем равен 0,25;

К_{отн.прон.} - коэффициент относительной проницаемости кожи человека и крысы или кролика для данного соединения (экспериментально установленный), ориентировочно равен 2;

S - площадь кожного покрова человека, в среднем равна 16120 см²;

К_з - коэффициент запаса определяется классом опасности соединения при острой дермальной экспозиции в соответствии с пунктом 5.2.4.

5.6.3. Коэффициент запаса для соединений 1 - 2 класса опасности по острой кожной токсичности равен от 20 до 10, для соединений 3 - 4 класса - от 10 до 3.

Для соединений, обладающих выраженными отдаленными и (или) специфическими эффектами, включая сенсибилизацию, коэффициент запаса может приниматься на уровне 20 и более. Для соединений, обладающих канцерогенным действием (2 класс опасности), коэффициент запаса равен 50.

5.6.4. Величина Lim_ch^cut (мг/кг) устанавливается экспериментально или рассчитывается по следующей формуле (12):

, мг/кг, (12)

где: LD₅₀^cut - средняя смертельная концентрация (доза) при однократном накожном нанесении, мг/кг;

К - коэффициент для соединений 1 - 2 класса опасности по острой кожной токсичности, составляет 0,0002; для соединений 3 - 4 класса опасности - 0,001.