III. Общие рекомендации к изучению местного раздражающего и кожно-резорбтивного действия химических соединений

3.1. Изучение местного раздражающего/разъедающего действия и резорбции соединения через кожу проводится для новых, внедряемых в производство химических соединений, для химических соединений, широко применяемых в промышленности, но не изученных при воздействии на кожные покровы, и для соединений, при контакте с которыми у работающих выявляются признаки отклонений в состоянии здоровья по данным профилактических медицинских осмотров <4>. Изучению подлежат соединения, находящиеся в жидком или твердом агрегатном состоянии. Устанавливать ПДУ для газообразных соединений не целесообразно, так как соблюдение предельно допустимой концентрации (далее - ПДК) соединения в воздухе рабочей зоны предохраняет организм от токсического воздействия при проникновении его через кожные покровы.

--------------------------------

<4> Приказ Минздрава России от 28.01.2021 N 29н "Об утверждении Порядка проведения обязательных предварительных и периодических медицинских осмотров работников, предусмотренных частью четвертой статьи 213 Трудового кодекса Российской Федерации, перечня медицинских противопоказаний к осуществлению работ с вредными и (или) опасными производственными факторами, а также работам, при выполнении которых проводятся обязательные предварительные и периодические медицинские осмотры" (зарегистрирован Минюстом России 29.01.2021, регистрационный N 62277), с изменениями, внесенными приказом Минздрава России от 01.02.2022 N 668н (зарегистрирован Минюстом России 09.09.2022, регистрационный N 67206).

3.2. Перед проведением исследований проводится анализ физико-химических свойств соединения, параметров токсичности при других путях поступления, некоторых специальных параметров: липофильность, коэффициент распределения октанол/вода (масло/вода); кислотные или щелочные свойства (pH); особенности технологического процесса для построения рабочей гипотезы о наличии и степени раздражающего эффекта, возможности проникновения через кожу, особенностях распределения и прогнозирования токсичности.

3.3. Исследования проводят после сбора и анализа всех доступных данных о раздражающих, токсических свойствах соединения, в том числе уже известных исследований на человеке и (или) лабораторных животных, проверенных и верифицированных данных в исследованиях in vitro, информации о раздражающем воздействии одного или нескольких структурно схожих соединений, что позволяет снизить потребность в исследованиях in vivo с позиции защиты животных.

3.4. Изучение воздействия химических соединений на кожные покровы с последующим обоснованием гигиенических нормативов проводится в 4 этапа:

3.4.1. Исследование и оценка местного действия.

3.4.2. Ориентировочная оценка кожно-резорбтивного действия, в том числе сенсибилизирующего.

3.4.3. Количественная оценка кожной резорбции с установлением:

а) среднесмертельной дозы (далее - LD₅₀) и среднеэффектного времени гибели животных (далее - TL₅₀);

б) порога Lim_ac^cut и зоны Z_ac^cut острого действия;

в) коэффициента кумуляции - K_cum^cut;

г) порога Lim_ch^cut и зоны Z_ch^cut хронического действия;

д) ПДУ загрязнения кожи или ОДУ загрязнения кожи.

3.4.4. Гигиенический контроль содержания вредных соединений на коже работающих с целью обоснования ПДУ загрязнения кожи и оценки риска кожно-резорбтивного действия.

3.5. Выбор животных.

3.5.1. В качестве подопытных животных используются белые крысы с исходной массой 200 - 220 г, мыши (18 - 22 г), морские свинки (300 - 350 г), кролики (2,0 - 3,0 кг). Эксперимент рекомендуется проводить на двух видах животных, включая белых крыс. Для изучения местного раздражающего действия в острых опытах используются кролики породы "Шиншилла", морские свинки - светлой масти.

3.5.2. Количество животных в группе - не менее 10 особей для морских свинок, крыс и мышей, и не менее 3 животных для кроликов. Допустимые различия в массе тела животных - 10% от средней массы.

3.5.3. При наличии информации о возможном выраженном раздражающем/разъедающем (коррозионном) действии соединения проводится предварительное испытание in vitro. Если на основании анализа имеющихся данных принимается решение проводить испытания in vivo, то исследования проводятся на одном животном. Если на одном животном выраженное раздражающее действие не подтвердилось, повторяется эксперимент на двух животных с экспозицией 4 часа. В зависимости от степени выраженности раздражения/повреждения принимается решение о признании разъедающего действия и о целесообразности дальнейшего изучения соединения. При отсутствии необратимых повреждений кожи (язвы, кровотечение, некроз) исследования раздражающего действия продолжаются.

3.6. Подготовка животных к эксперименту.

3.6.1. Участок аппликации составляет не менее 5% от общей поверхности кожи животных, что соответствует 2/3 хвоста у крыс и мышей, или участку кожи на спине крыс 4 x 4 см, кроликов 7 x 8 см, морских свинок 5 x 5 см.

3.6.2. За 1 - 2 дня до эксперимента выстригают ножницами или электробритвой шерсть на спине, обеспечивая доступ к коже животного. В опыте целесообразно использовать животных с чистой, здоровой кожей без механических повреждений. Для изучения местного действия шерсть выстригают на симметричных участках спины по обе стороны от позвоночника, оставляя шерстяной покров между ними в 2 см. Правый бок служит для аппликации изучаемого соединения, левый - для контроля.

3.6.3. Для изучения кожной резорбции исследуют один бок животного, при этом контролем служит другая группа животных.

3.6.4. На время экспозиции для исключения слизывания соединения с кожи и поступления его через органы дыхания животные фиксируются наиболее физиологичным способом. С этой целью применяются специальные станки, либо полужесткие воротники (из резины, пластика); морские свинки, мыши и белые крысы помещаются в индивидуальные домики (рестрейнеры).

3.6.5. Время экспозиции - 4 часа для всех видов животных, кроме мышей, контакт для которых составляет 2 часа. Время наблюдения после однократной аппликации: 1 час, 24, 48, 72 часа, 14 дней.

3.7. Способ нанесения.

3.7.1. Исследуемое соединение наносится на 5% участок кожи животного в дозированных количествах из расчета на 1 кг массы тела и на 1 см² поверхности кожного покрова и равномерно распределяется.

3.7.2. Рекомендуется, чтобы проба исследуемого соединения соответствовала чистому соединению или смеси соединений, которые потенциально могут воздействовать на человека в реальных производственных условиях. Допустимо проводить исследование с использованием радиоактивных меток.

3.7.3. Изучаемое соединение наносят, преимущественно, в чистом виде. В случае невозможности нанесения соединения в чистом виде, а также при наличии выраженного раздражающего либо токсического эффекта, исследуют разведения изучаемых соединений. В качестве растворителей и разбавителей допустимо использовать дистиллированную воду, физиологический раствор, модельную среду, имитирующую потовую жидкость (таблица 1). При невозможности разведения соединения в перечисленных выше растворителях допускается применение растительного и вазелинового масла, ланолина, этилового спирта или ацетона.

Таблица 1

Модель "потовой жидкости"

3.7.4. Нанесение соединения осуществляется открытым способом или под негерметичной повязкой, например, нейлоновой, марлевой. В случае если прямое наложение невозможно (например, с жидкостями или некоторыми пастами), соединение наносят на марлевую повязку, а затем прикладывают к коже таким образом, чтобы соединение было равномерно распределено по повязке, повязка не сдавливала животное, но удерживалась посредством подходящего материала на протяжении всего периода воздействия, плотно контактируя с кожей животного.

Для высоколетучих соединений (температура кипения до плюс 100 °C) используют закрытый способ нанесения: метод наклейки капсул и часовых стекол. После нанесения соединения на кожу, обработанное место может быть защищено специальным стандартным устройством (рисунок).

Рисунок. Пример стандартного устройства, используемого

для ограничения и защиты места нанесения соединения

во время исследований перкутанной абсорбции in vivo.

Примечания: 1 - вид стандартного устройства снаружи;

2 - схема стандартного устройства изнутри; А - фильтр

из активированного угля или марлевая повязка; Б - насадка

с резьбой; В - основа с резьбой; Г - кожа;

Д - цианоакрилатный клей

В случае возможного испарения соединение допустимо улавливать угольными фильтрами устройства. После нанесения на выстриженную кожу спины животного, зафиксированного в станке, точного количества изучаемого соединения, этот участок кожи покрывается раструбом обычной стеклянной воронки, имеющей по бокам специально сделанные 4 отверстия диаметром 2 - 3 мм. Воронка плотно фиксируется на теле животного цианоакрилатным клеем. Затем воронка соединяется с поглотителем Рихтера (или какими-либо другими поглотителями) при помощи изогнутой под прямым углом стеклянной трубки, концы которой соединены резиновыми муфтами с одной стороны с горловиной воронки, а с другой с входным концом трубки поглотителя. После этого при помощи аспиратора начинается отсос воздуха с парами исследуемого соединения из-под воронки при объемной скорости 10 - 50 мл воздуха в минуту и так далее. В зависимости от целей эксперимента и летучести соединения продолжительность отсасывания воздуха из-под воронки может составлять до 4 часов. В течение опыта поглотители можно несколько раз заменить на новые, если стоит задача изучить динамику испарения соединения с поверхности кожи. Количество испарившегося соединения определяется в поглотительном растворе химико-аналитическими или другими подходящими для этой задачи методами. После окончания опыта производятся смывы с данного участка кожи, чтобы определить остаточное количество соединения. Из общей дозы, нанесенной на кожу, производится вычитание количества испарившегося соединения и оставшегося на коже. В итоге устанавливается количество соединения, поступившее в организм через кожу.

При изучении кожно-резорбтивного действия в длительном (подострый, хронический) эксперименте, испытуемое соединение наносится на кожу 2/3 поверхности хвоста мышей или крыс, который для этого помещается в стеклянную коническую пробирку на время экспозиции. Используемые лабораторные животные фиксируются путем помещения в специальные индивидуальные домики (рестрейнеры).

3.7.5. Эксперимент проводят при контролируемых параметрах микроклимата: температуре воздуха в помещении плюс (22 3) °C (для грызунов) и (20 3) °C (для кроликов); относительной влажности воздуха 30 - 70% (оптимально 50 - 60%).

В местах содержания и проведения манипуляций с животными обеспечивается искусственное освещение: 12 часов - свет, 12 часов - темнота. При кормлении может быть использована обычная лабораторная диета с неограниченным количеством питьевой воды.

3.7.6. Контрольные животные содержатся в одинаковых условиях. На соответствующие участки кожи им наносится растворитель или разбавитель, используемый в опыте. При изучении местного действия контролем служит противоположный участок кожи того же животного.

3.8. Способ смыва.

3.8.1. После окончания экспозиции остатки соединения удаляются теплой водой с мылом, избегая грубых приемов и манипуляций, способных вызывать повреждение кожи.

3.8.2. Установление количественных параметров токсичности при резорбции соединения возможно при условии получения сведений о количестве соединения, проникшего в организм. С этой целью определяют остаточные количества соединения на коже. Определение соединения в смывах проводится сразу после экспозиции при установлении LD₅₀, Lim_ac^cut и Lim_ch^cut (не менее 8 раз в течение хронического эксперимента).

3.8.3. Как для проведения смыва, так и для его анализа рекомендуется применять специфический избирательный химический метод. При выборе жидкости, применяемой для смыва, учитывают:

а) способность жидкости растворять искомые соединения;

б) безвредность ее как для кожи, так и для целостного организма (например, этиловый спирт, слабая кислота, слабая щелочь).

3.8.4. Специально обработанной хлопчатобумажной салфеткой, смоченной в жидкости, с помощью пинцета проводят смыв с участка кожи, на котором проводили аппликацию соединения (таблица 2). Манипуляция повторяется не менее 3 раз. После каждого контакта с кожей салфетка промывается в смывающей жидкости. Пробу смыва (емкость со смывающей жидкостью и салфетка) помещают в емкость с крышкой, маркируют и помещают в контейнер для транспортировки в аналитическую лабораторию.

Таблица 2

Средства для проведения смыва

--------------------------------

<5> ГОСТ 21241-2023 "Пинцеты медицинские. Общие технические требования и методы испытаний", введенный приказом Росстандарта от 22.09.2023 N 929-ст.

3.8.5. Для малолетучих соединений количество соединений, проникшее в организм, рассчитывают по формуле (1) или по формуле (2):

, мг/кг, (1)

где: C - количество соединения, проникшее в организм, в мг/кг;

A - количество соединения, нанесенное на кожу, в мг;

B - количество соединения в смыве в мг;

M - масса тела в г.

, мг/см², (2)

где: C - количество соединения, проникшее в организм, в мг/см²;

A - количество соединения, нанесенное на кожу, в мг;

B - количество соединения в смывах в мг;

S - участок аппликации соединения на коже в см².

Для летучих соединений в формулы 1 и 2 вносят поправку на испарение (п. 3.7.4).

3.8.6. При наличии возможности определения соединения или его метаболитов в биосредах расчет проникшего в организм соединения производят, исходя из определяемых количеств.