"Р 1.2.4109-24. 1.2. Гигиена, токсикология, санитария. Комплексный подход к тестированию и оценке способности химических веществ оказывать воздействие на эндокринную систему. Руководство" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 25.12.2024)

IV. Методы исследования

4.1. Разработана концептуальная модель оценки токсичности химических веществ, воздействующих на эндокринную систему, включающая 5 уровней исследования (табл. 4.1) <4>.

--------------------------------

<4> Примечание: полные наименования методов исследования представлены в приложении 2 к настоящему Руководству.

Таблица 4.1

Концептуальная модель оценки токсичности химических веществ,

воздействующих на эндокринную систему <5>

--------------------------------

<5> Руководство ОЭСР N 150.

Уровень 1. Литературные данные, методы in silico

- все доступные данные;

- физико-химические свойства;

- токсикологические и экотоксикологические показатели;

- методы in silico (англ. read-across)

Уровень 2. Методы in vitro

- сродство связывания эстрогена (Метод ОЭСР N 493);

- сродство связывания андрогеновых рецепторов (US EPA TG OPPTS 890.1150);

- исследование транскрипционной активации, опосредованной стабильно трансфицированным человеческим Рисунок 2 эстрогена, для выявления эстроген-агонистической активности веществ (Метод ОЭСР N 455);

- скрининг по эстрогену с использованием штамма дрожжей;

- анализ транскрипционной активации стабильно трансфицированных андрогеновых рецепторов человека для обнаружения андрогенной агонистической и антагонистической активности химических веществ (Метод ОЭСР N 458);

- H295R in vitro тест на стероидогенез с использованием человеческой клеточной линии адренокарциномы (Метод ОЭСР N 456);

- анализ ароматазы (US EPA TG OPPTS 890.1200);

- анализ нарушения работы щитовидной железы (например, ингибирование тиреопероксидазы, связывание транстиретина);

- анализ трансактивации ретиноидных рецепторов;

- анализ других гормональных рецепторов при необходимости;

- скрининг с высокой пропускной способностью

Уровень 3. Методы in vivo, механизмы действия

Млекопитающие

Немлекопитающие

- утеротропный биотест на грызунах: краткосрочный скрининг-тест для выявления эстрогенной активности (Метод ОЭСР N 440);

- тест Хешбергера на крысах (Метод ОЭСР N 441)

- анализ метаморфоза земноводных (Метод ОЭСР N 231);

- оценка репродуктивной способности рыб (Метод ОЭСР N 229);

- 21-дневное исследование на рыбах (Метод ОЭСР N 230);

- скрининг андрогенизированной самки колюшки (Метод ОЭСР N 148);

- обнаружение веществ, действующих через рецепторы эстрогена, с использованием трансгенных эмбрионов cyp19a1b GFP Danio rerio;

- анализ передачи сигналов щитовидной железы эмбриона Xenopus;

- скрининговый анализ антиандрогенов у ювенильной медаки;

- кратковременный скрининг активности ювенильных гормонов с использованием Daphnia magna;

- быстрый репортерный анализ неблагоприятных последствий андрогенного нарушения

Уровень 4. Методы in vivo, механизмы действия и неблагоприятные эффекты

Млекопитающие

Немлекопитающие

- изучение пероральной токсичности при повторном воздействии в 28-дневных опытах на грызунах (Метод ОЭСР N 407);

- изучение пероральной токсичности при повторном воздействии в 90-дневных опытах на грызунах (Метод ОЭСР N 408);

- исследование пубертатного развития и функции щитовидной железы у крыс-самцов перипубертатного периода (анализ самцов PP) (US EPA TG OPPTS 890.1500);

- исследование пубертатного развития и функции щитовидной железы у самок крыс в перипубертатном возрасте (анализ самок PP) (US EPA TG OPPTS 890.1450);

- оценка токсического действия на пренатальное развитие (Метод ОЭСР N 414);

- комбинированные исследования хронической токсичности и канцерогенности (Методы ОЭСР N 451, 452, 453);

- оценка репродуктивной (эмбриональной) токсичности скрининговым методом (Метод ОЭСР N 421);

- совместное исследование токсичности при повторном воздействии с репродуктивной (эмбриональной) токсичностью (Метод ОЭСР N 422);

- исследование нейротоксичности в процессе онтогенеза (Метод ОЭСР N 426);

- кожная токсичность при повторных дозах: 21/28-дневное исследование (Метод ОЭСР N 410);

- субхроническая кожная токсичность: 90-дневное исследование (Метод ОЭСР N 411);

- оценка подострой токсичности при ингаляционном поступлении: 28-дневное исследование (Метод ОЭСР N 412);

- оценка субхронической токсичности при ингаляционном поступлении в 90-дневном исследовании (Метод ОЭСР N 413);

- изучение пероральной токсичности при повторном воздействии в 90-дневных опытах на негрызунах (Метод ОЭСР N 409)

- испытания по воздействию на половозрелость рыб (Метод ОЭСР N 234);

- исследование роста и развития личинок земноводных (Метод ОЭСР N 241);

- птицы: репродукционный тест (Метод ОЭСР N 206);

- определение токсичности для рыб на ранних стадиях развития (Метод ОЭСР N 210);

- новый руководящий документ по тесту развития и размножения гарпактикоидов с Amphiascus (РД ОЭСР N 201);

- тест на размножение Potamopyrgus antipodarum (Метод ОЭСР N 242);

- тест на размножение Lymnaea stagnalis (Метод ОЭСР N 243);

- тест на токсичность хирономида (Методы ОЭСР N 218, 219);

- тест на размножение Daphnia (с индукцией самцов) (Метод ОЭСР N 211)

Уровень 5. Методы in vivo, расширенные исследования

Млекопитающие

Немлекопитающие

- расширенное изучение репродуктивной токсичности на одном поколении (Метод ОЭСР N 443);

- оценка репродуктивной токсичности на 2 поколениях (Метод ОЭСР N 416)

- тест на токсичность для рыб на протяжении жизненного цикла (US EPA TG OPPTS 850.1500);

- расширенный тест на воспроизводство одного поколения медаки (Метод ОЭСР N 240);

- тест на токсичность двух поколений птиц Coturnix japonica (US EPA TG OCSPP 890.2100/740-C-15-003);

- испытание токсичности на хирономидах на протяжении цикла развития с использованием седиментационной воды (Метод ОЭСР N 233);

- тест на нескольких поколениях дафний для оценки эндокринных разрушителей;

- расширенный тест воспроизводства Danio rerio в одном поколении

4.1.1. Уровень 1 предполагает сбор информации о веществе и его аналогах из открытых источников (физико-химические показатели, параметры (эко)токсичности), а также прогноз опасности с использованием методов in silico.

4.1.1.1. Источниками информации, используемыми для сбора литературных данных о веществе, являются оригинальные статьи, размещенные в научных журналах, монографии, авторефераты диссертационных работ, отечественные и международные базы данных государственных структур и организаций.

4.1.1.2. При анализе литературных данных рекомендуется обращать внимание на полноту представленных результатов (наличие соответствия требованиям надлежащей лабораторной практики (англ. Good Laboratory Practice - GLP), условия проведения эксперимента, пути введения вещества, тест-объекты, статистическая достоверность полученных данных).

4.1.1.3. Одним из методов in silico является прогнозирование с использованием программного обеспечения ОЭСР QSAR Toolbox <6> (далее - программа).

--------------------------------

<6> Официальный сайт программного обеспечения "Количественное соотношение структура-свойства" (англ. "Quantitative Structure-Activity Relationship Toolbox") и вспомогательных материалов: qsartoolbox.org (в свободном доступе) (далее - ОЭСР QSAR Toolbox).

Примечание: допускается использование аналогичных или с лучшими характеристиками программных средств для расчета физико-химических и (эко)токсикологических параметров химических веществ и смесей, поиска аналогов, сбора литературных данных, моделирования процессов метаболизма химических веществ, построения моделей.

Программа предназначена для расчета физико-химических и (эко)токсикологических параметров химических веществ и смесей, поиска аналогов, сбора литературных данных, моделирования процессов метаболизма химических веществ, построения моделей (Q)SAR.

4.1.1.4. Расчет показателей (параметров) с использованием программы осуществляется последовательным выполнением 6 шагов:

- ввода данных - в программе задается химическое вещество, для которого будет производиться расчет;

- профилированием - программой по заложенным алгоритмам анализируются структурные и электронные особенности химического вещества;

- поиском литературных данных для химического вещества;

- определением категории - программой с учетом структурных и электронных особенностей химического вещества, возможности образования метаболитов, рассчитываемого показателя (параметра) подбираются аналоги, изучается вопрос о наличии экспериментальных данных для аналогов;

- заполнением пробелов - программой по заложенным алгоритмам рассчитывается показатель (параметр), определяется погрешность определения;

- выводом данных на печать (при необходимости).

4.1.1.5. Программа позволяет прогнозировать значения 3 параметров, характеризующих воздействие химических веществ на эндокринную систему:

- сродство связывания эстрогеновых рецепторов;

- сродство связывания андрогеновых рецепторов;

- ингибирование ароматазы.

4.1.1.6. В программе интегрирована схема пути неблагоприятного исхода <7> (AOP) для воздействия химического вещества на эндокринную систему организма. AOP представляет собой последовательность фактов и событий, вызванных химическим веществом, включая исходное молекулярное событие, воздействие на субклеточном, клеточном, органном, организменном и популяционном уровнях.

--------------------------------

<7> Примечание: путь неблагоприятного исхода (англ. Adverse outcome pathway, далее - AOP).

4.1.1.7. Примеры расчетов показателей, характеризующих воздействие химических веществ на эндокринную систему, в том числе с использованием AOP, приведены в приложении 3 к настоящему Руководству.

4.1.1.8. Результаты расчетов сродства связывания эстрогеновых и андрогеновых рецепторов с использованием программного обеспечения ОЭСР QSAR Toolbox представлены в приложении 4 к настоящему Руководству.

4.1.1.9. Другие программные средства, позволяющие оценивать воздействие химических веществ на эндокринную систему организма, приведены в приложении 5 к настоящему Руководству.

4.1.2. Уровень 2 включает методы in vitro, указывающие на эндокринно-обусловленные механизмы воздействия химических веществ.

4.1.3. Уровень 3 включает методы in vivo, указывающие на эндокринно-обусловленные механизмы воздействия химических веществ и в некоторых случаях проявления эффектов.

При интерпретации данных, полученных методами уровня 3 в некоторых случаях, необходимо искать подтверждения наличия (отсутствие) эффекта методами уровня 2 (взаимодействие с рецепторами гормонов) [38].

Например, при интерпретации результатов, полученных в тесте Хершбергера (метод ОЭСР N 441), рекомендуется проводить дополнительные исследования in vitro для определения агонистических или антагонистических эффектов химических веществ (методы ОЭСР N 455, 456, 458).

4.1.4. Уровень 4 включает исследования in vivo, которые представляют информацию о неблагоприятных эндокринно-обусловленных эффектах.

4.1.4.1. Методы уровня 4 включают:

- исследования подострой, субхронической и хронической токсичности при различных путях поступления (пероральный, ингаляционный, накожный);

- комбинированные исследования хронической токсичности и канцерогенной активности;

- оценку токсического действия на пренатальное развитие;

- оценку репродуктивной (эмбриональной) токсичности (скрининговый метод);

- совместное исследования токсичности при повторном воздействии с репродуктивной (эмбриональной) токсичностью (скрининговый метод);

- исследования нейротоксичности в процессе онтогенеза;

- исследования на немлекопитающих (например, простейшие, дафнии, рыбы, земноводные, хирономиды, пресноводные моллюски, почвенные беспозвоночные).

4.1.5. Уровень 5 включает методы in vivo, представляющие расширенную информацию о неблагоприятных эндокринно-обусловленных эффектах, установленных на длительных этапах жизненного цикла организма.

4.1.5.1. Методы уровня 5 включают:

- расширенное изучение репродуктивной токсичности на одном поколении;

- исследования репродуктивной токсичности на двух поколениях;

- исследования на немлекопитающих (простейшие, дафнии, рыбы, хирономиды, птицы).

4.1.5.2. Для изучения эндокринно-обусловленного воздействия химического вещества рекомендуется использовать расширенное изучение репродуктивной токсичности на одном поколении, так как оно позволяет оценить ряд эндокринно-обусловленных нарушений не только у взрослых особей грызунов поколения F1, но и у молодняка, что не рассматривается в исследовании репродуктивной токсичности на двух поколениях.

4.1.5.3. При интерпретации данных о репротоксическом эффекте используются доказательства эндокринного механизма действия.

4.1.5.4. К методам уровня 5 могут быть отнесены клинико-диагностические и эпидемиологические исследования, выполненные на людях.

4.2. Оценка селективности приоритетных методов исследования, позволяющих установить механизмы и оценить эффекты воздействия эндокринных разрушителей, представлены в табл. 4.2. Табл. 4.2 носит информативный характер и не отражает, какие методы исследования являются наиболее актуальными или имеют наибольшее количество ответов на воздействие.

Таблица 4.2

Селективность приоритетных методов исследования

по механизму действия <8>

--------------------------------

<8> Руководство ОЭСР N 150.

Наименование метода

Уровень метода

Потенциальные механизмы эндокринного действия

Э

А

С

Щ

Ю

Эк

Р

Сродство связывания эстрогена (Метод ОЭСР N 493)

2

#

Исследование транскрипционной активации, опосредованной стабильно трансфицированным человеческим Рисунок 3 эстрогена, для выявления эстроген-агонистической активности веществ (Метод ОЭСР N 455)

2

#

Анализ транскрипционной активации стабильно трансфицированных андрогеновых рецепторов человека для обнаружения андрогенной агонистической и антагонистической активности химических веществ (Метод ОЭСР N 458)

2

#

H295R in vitro тест на стероидогенез с использованием человеческой клеточной линии адренокарциномы (Метод ОЭСР N 456)

2

#

Сродство связывания андрогеновых рецепторов (US EPA TG OPPTS 890.1150)

2

#

Анализ ароматазы (US EPA TG OPPTS 890.1200)

2

#

Утеротропный биотест на грызунах: краткосрочный скрининг-тест для выявления эстрогенной активности (Метод ОЭСР N 440)

3

#

Тест Хешбергера на крысах (Метод ОЭСР N 441)

3

#

#

Оценка репродуктивной способности рыб (Метод ОЭСР N 229)

3

#

#

#

21-дневное исследование на рыбах (Метод ОЭСР N 230)

3

#

#

#

Анализ метаморфоза земноводных (Метод ОЭСР N 231)

3

#

Скрининг андрогенизированной самки колюшки (Метод ОЭСР N 148)

3

#

Обнаружение веществ, действующих через рецепторы эстрогена, с использованием трансгенных эмбрионов cyp19a1b GFP Danio rerio

3

#

Скрининговый анализ антиандрогенов у ювенильной медаки

3

#

Анализ передачи сигналов щитовидной железы эмбриона Xenopus

3

#

Быстрый репортерный анализ неблагоприятных последствий андрогенного нарушения

3

#

Кратковременный скрининг активности ювенильных гормонов с использованием Daphnia magna

3

&

Изучение пероральной токсичности при повторном воздействии в 28-дневных опытах на грызунах (Метод ОЭСР N 407)

4

#

#

#

#

&

Изучение пероральной токсичности при повторном воздействии в 90-дневных опытах на грызунах (Метод ОЭСР N 408)

4

#

#

#

#

&

Комбинированные исследования хронической токсичности и канцерогенности (Методы ОЭСР N 451, 452, 453)

4

#

#

#

#

&

28-дневная совместная оценка репродуктивной/эмбриональной токсичности (скрининговый метод) (Методы ОЭСР N 421, 422)

4

#

#

#

#

&

Оценка токсического действия на пренатальное развитие (Метод ОЭСР N 414)

4

#

#

#

#

&

Исследование нейротоксичности в процессе онтогенеза (Метод ОЭСР N 426)

4

#

#

#

#

&

Кожная токсичность при повторных дозах: 21/28-дневное исследование (Метод ОЭСР N 410)

4

#

#

#

&

Субхроническая кожная токсичность: 90-дневное исследование (Метод ОЭСР N 411)

4

#

#

#

#

&

Оценка подострой токсичности при ингаляционном поступлении в 28-дневном исследовании (Метод ОЭСР N 412)

4

#

#

#

#

&

Оценка субхронической токсичности при ингаляционном поступлении в 90-дневном исследовании (Метод ОЭСР N 413)

4

#

#

#

#

&

Изучение пероральной токсичности при повторном воздействии в 90-дневных опытах на негрызунах (Метод ОЭСР N 409)

4

#

#

#

#

&

Исследование пубертатного развития и функции щитовидной железы у крыс-самцов перипубертатного периода (анализ самцов PP) (US EPA OPPTS 890.1500)

4

#

#

#

#

&

Исследование пубертатного развития и функции щитовидной железы у самок крыс в перипубертатном периоде (US EPA OPPTS 890.1450)

4

#

#

#

#

&

Определение токсичности для рыб на ранних стадиях развития (Метод ОЭСР N 210)

4

&

Испытание по воздействию на половозрелость рыб (Метод ОЭСР N 234)

4

#

#

#

&

Исследование роста и развития личинок земноводных (Метод ОЭСР N 241)

4

#

#

&

#

Птицы: репродукционный тест (Метод ОЭСР N 206)

4

&

&

&

&

Тест на размножение Potamopyrgus antipodarum (Метод ОЭСР N 242)

4

&

Тест на размножение Lymnaea stagnalis (Метод ОЭСР N 243)

4

&

Тест на токсичность хирономида (Методы ОЭСР N 218, 219)

4

&

&

Тест на размножение Daphnia (с индукцией самцов) (Метод ОЭСР N 211)

4

&

&

Новый руководящий документ по тесту развития и размножения гарпактикоидов с Amphiascus (РД ОЭСР N 201)

4

&

&

Оценка репродуктивной токсичности на двух поколениях (Метод ОЭСР N 416)

5

#

#

#

#

&

Расширенное изучение репродуктивной токсичности на одном поколении (Метод ОЭСР N 443)

5

#

#

#

#

&

Расширенный тест на воспроизводство одного поколения медаки (Метод ОЭСР N 240)

5

#

#

#

&

Тест на токсичность для рыб на протяжении жизненного цикла (US EPA OPPTS 850.1500)

5

&

&

&

&

Расширенный тест воспроизводства Danio rerio в одном поколении

5

#

#

#

&

Тест на токсичность двух поколений птиц Coturnix japonica (US EPA TG OCSPP 890.2100/740-C-15-003)

5

#

#

&

#

Испытание токсичности на хирономидах на протяжении цикла развития с использованием седиментационной воды (Метод ОЭСР N 233)

5

&

&

Тест на нескольких поколениях Daphnia для оценки эндокринных разрушителей

5

&

&

КонсультантПлюс: примечание.

В официальном тексте документа, ячейки, выделенные темно-синим цветом, в электронной версии документа обозначены знаком #, выделенные светло-голубым цветом - обозначены знаком &.

Примечание:

Темно-синий цвет - ответ в тесте вызван данным эндокринно-обусловленным механизмом и подтверждает его.

Светло-голубой цвет - ответ в тесте вызван данным эндокринно-обусловленным механизмом, но не подтверждает его.

Э - эстроген-опосредованный; А - андроген-опосредованный; Щ - опосредованный гормонами щитовидной железы; С - вмешательство в стероидогенез; Ю - ювенильные гормоны; Эк - экдистероидные гормоны; Р - метаболизм ретиноевой кислоты.

4.3. Концептуальная модель оценки токсичности химических веществ, воздействующих на эндокринную систему, на основании уровневого подхода не является стратегией тестирования, которой нужно следовать линейно от 1 до 5 уровня. Линейный подход к тестированию рекомендуется для новых и (или) малоизученных химических веществ.

4.4. Назначение (цели, задачи), контрольные точки и ограничения приоритетных методов тестирования эндокринных разрушителей представлены в приложении 6 к настоящему Руководству.

4.5. Обобщенные условия проведения приоритетных методов тестирования эндокринных разрушителей представлены в приложении 7 к настоящему Руководству.

4.6. Нестандартизированные методы исследования рекомендуется относить к одному из уровней по признакам:

- тип метода (in silico, in vitro, in vivo);

- тест-объект;

- длительность проведения;

- путь поступления.

4.7. При интерпретации литературных данных рекомендуется сопоставлять исследуемые дозы (концентрации), при воздействии которых наблюдались эндокринно-обусловленные нарушения с параметрами острой токсичности вещества. Результаты, полученные в испытании доз и концентраций, близких к летальным (DL50, CL50), не следует учитывать [36 - 44].

III. Этапность и уровни исследования эндокринных разрушителей V. Комплексный подход к классификации опасности эндокринных разрушителей