|
Интерпретация результатов
|
Определение эквивалентности максимального ответа, вызванного тестируемым веществом, 10% величины ответа, вызванного концентрацией 1 нМ E2, используемого в качестве PC10
|
Позитивный эффект рассчитывается по кривой концентрация-ответ, содержащей как минимум три точки с неперекрывающимися доверительными интервалами, при условии, что максимальное среднее нормализированное значение для тестируемого вещества составляет не менее чем 20% от максимального значения для референсного контроля (E2)
|
|
Описание метода
|
Для контроля стабильности клеточной линии в качестве референсных веществ используют E2,  ,  и кортикостерон. Положительный контроль (1 нМ E2) проверяют на каждом планшете, по крайней мере, в трех повторностях.
Обычно тестируемые вещества растворяют в диметилсульфоксиде (далее - ДМСО) или другом подходящем растворителе в соотношении 1:10 для получения раствора требуемой концентрации и последующего разведения в культуральной среде. Тестируемое вещество проверяют при максимальной концентрации в 1 мкл/мл, 1 мг/мл или 1 мМ
|
Референсным стандартом является E2. При определении интервала концентраций референсный стандарт используется в четырех последовательных разведениях E2 (1,84 · 10-10, 4,59 · 10-11, 1,15 · 10-11 и 2,87 · 10-12 М), каждая концентрация тестируется в двух повторностях (в двух лунках).
При полном исследовании референсный стандарт E2 включает 11 последовательных разведений с шагом 1:2 (от 3,67 · 10-10 до 3,59 · 10-13 М) в двух повторностях (в двух лунках).
При определении интервала проверяемых концентраций используют 7 последовательных разведений тестируемого вещества с шагом 1:10 в двух повторностях. Первоначально тестируемое вещество проверяют вплоть до максимальной концентрации 1 мг/мл (~ 1 мМ)
|
|
Анализ и интерпретация данных
|
Для каждого тестируемого вещества определяют следующие параметры:
- RPCMax - максимальный уровень ответа, вызванный тестируемым веществом и выраженный как процент от ответа на 1 нМ E2 на том же самом планшете; а также PCMax (концентрация, при которой достигается RPCMax);
- для положительных веществ - концентрация, которая соответствует PC10 и, если возможно, PC50. Результаты должны базироваться на двух (или трех) независимых сериях теста.
Положительные результаты характеризуются двумя величинами: величиной эффекта и концентрацией, при которой наблюдается эффект. Представление результатов в виде концентраций, при которых достигаются 50% (PC50) или 10% (PC10) от величины положительного контроля, удовлетворяет данным требованиям. Тестируемое вещество считается соответствующим положительному критерию, если максимальный ответ, вызванный этим веществом (RPCMax), равен или превышает 10% от величины положительного контроля, по крайней мере, в двух из двух или в двух из трех сериях. Тестируемое вещество считается соответствующим негативному критерию, если максимальный ответ, вызванный этим веществом (RPCMax), не достигает 10% от величины положительного контроля, по крайней мере, в двух из двух или в двух из трех серий
|
Все вещества, классифицируемые как положительные, т.е. проявляющие эстроген-агонистическую активность, должны давать кривую концентрация-ответ, состоящую из базовой линии с последующим подъемом активации, переходящим в плато или горб.
В отдельных случаях могут наблюдаться только два из этих характерных участков (базовая линия и подъем или подъем и пик).
Линия, характеризующая наклон подъема, должна содержать как минимум три точки с неперекрывающимися диапазонами. При этом точки, составляющие базовую линию, исключаются из рассмотрения, однако линейная часть подъема может включать собственно пиковое значение или первую точку, попадающую на плато.
Вещество классифицируется как положительное, если амплитуда активации (разница между базовой линией и пиковым значением) составляет, как минимум, 20% от максимального значения для E2.
При возможности для каждого положительно классифицированного вещества следует рассчитать величину EC50
|
эстрогена, для выявления
с незначительным 
(на основе человеческой цервикальной опухоли)