|
Интерпретация результатов
|
Интерпретация данных об агонистическом эффекте андрогеновых рецепторов основана на максимальном уровне реакции, вызванном тестируемым химическим веществом.
Если ответ равен или превышает 10% ответа, вызванного 10 нМ  , контрольный агонист андрогеновых рецепторов (log PC10), тестируемое химическое вещество считается положительным.
Интерпретация данных для AR-антагонистического эффекта тестируемого химического вещества основано на пороге 30% ингибирующего ответа против 500 пМ  (log IC30). Если ответ блокирования андрогеновых рецепторов превышает 30%, то химическое вещество считается положительным антагонистом андрогеновых рецепторов
|
Испытуемое химическое вещество считается положительным на агонизм, если по крайней мере две последовательные концентрации испытуемого химического вещества показывают реакцию, равную или превышающую 10% от максимальной реакции эталонного стандарта  (PC10).
Испытуемое химическое вещество считается положительным на антагонизм, если по крайней мере две последовательные концентрации испытуемого химического вещества показывают реакцию, равную или меньшую, чем 80% максимальной реакции эталонного стандарта флутамида и критерии контроля специфичности соблюдены
|
Интерпретация данных об агонистическом эффекте андрогеновых рецепторов основана на максимальном уровне ответа, вызываемом тестируемым химическим веществом. Если этот ответ равен или превышает 10% ответа, вызванного 10 нМ  , контрольным агонистом андрогеновых рецепторов, тестируемое химическое вещество считается агонистом андрогеновых рецепторов.
Интерпретация данных об антагонистическом эффекте андрогеновых рецепторов тестируемого химического вещества осуществляется в два этапа:
1) пороговое значение ингибирующей реакции испытуемого вещества на 30% в присутствии 800 мкМ  ;
2) значение R2 < 0,9 в тесте контроля специфичности. Если оба критерия соблюдены, химическое вещество считается антагонистом андрогеновых рецепторов
|
|
Описание метода
|
Для мониторинга стабильности клеточной линии для анализа агонистов в качестве эталонных стандартов используются дигидротестостерон, местанолон и ди(2-этилгексил)фталат, для антагонистов - гидроксифлутамид, бисфенол А и ди(2-этилгексил)фталат. Приемлемый диапазон эталонных стандартов для анализа агонистов андрогеновых рецепторов: для  и местанолона 1,0 · 10-12 ~ 1,0 · 10-6 М, для ди(2-этилгексил)фталата 1,0 · 10-11 ~ 1,0 · 10-5 М; для анализа антагонистов: гидроксифлутамид, бисфенол А и ди(2-этилгексил)фталат: 1,0 · 10-10 ~ 1,0 · 10-5 М. Средняя люциферазная активность (10 нМ  ) должна быть равна или превышать 6,4-кратное значение по сравнению со средним значением на каждом планшете для анализа агониста.
Средняя люциферазная активность (500 пМ  ) должна быть равна или выше в 5,0 раз по сравнению со средним значением на каждом планшете для анализа антагонизма. Каждое тестируемое вещество необходимо серийно разводить в ДМСО с коэффициентом разбавления 10 (1 мМ, 100 мкМ, 10 мкМ, 1 мкМ, 100 нМ, 10 нМ и 1 нМ [10-3 - 10-9 М]) для трехкратного тестирования. После добавления вещества планшеты инкубируют в инкубаторе с 5% CO2 при температуре плюс 37  1 °C в течение 20 - 24 часов для индукции продуктов репортерного гена
|
Для мониторинга стабильности клеточной линии для анализа агонистов в качестве эталонных стандартов используются дигидротестостерон,  , кортикостерон, для антагонистов - флутамид, линурон, левоноргестрел. Концентрации эталонных стандартов агонистов: дигидротестостерон 1,0 · 10-11 - 1,0 · 10-7, 17-метилтестостерон 1,0 · 10-7, кортикостерон 1,0 · 10-6. Концентрации эталонных стандартов антагонистов: флутамид 1,0 · 10-8 - 3,0 · 10-5, линурон 1,0 · 10-5, левоноргестрел 1,0 · 10-6.
Испытуемые химические вещества должны оцениваться при максимальной концентрации 0,1 М (маточный раствор). Во время предварительного скрининга тестируются серийные разведения тестируемого вещества 1:10. Все эталонные стандарты, тестовые химикаты и контрольные растворители тестируются в трех повторностях. 96-луночные титрационные микропланшеты следует инкубировать еще 24  2 часа в CO2 инкубаторе (5  1% CO2, температура плюс 37  1 °C).
|
Эталонные стандарты для каждого анализа должны быть включены в один планшет каждого прогона. Для анализа агонистов андрогеновых рецепторов должны быть включены: три хорошо изученных эталонных стандарта; два положительных эталонных стандарта (дигидротестостерон и местанолон) и один отрицательный эталонный стандарт (диэтилгексилфталат). Эталонные стандарты для анализа антагониста андрогеновых рецепторов включают два положительных эталонных стандарта (бикалутамид и бисфенол А) и один отрицательный эталонный стандарт (ди(2-этилгексил)фталат). Испытательный диапазон концентраций в анализе агонистов:  и местанолон от 1,0 · 10-6 до 1,0 · 10-12 М; диэтилгексилфталат от 1,0 · 10-5 до 1,0 · 10-11 М; в анализе антагонистов: бикалутамид от 1,0 · 10-4 до 1,0 · 10-10 М; бисфенол А и диэтилгексилфталат от 1,0 · 10-5 до 1,0 · 10-11 М. Испытуемые химические вещества готовятся с максимальной концентрацией до 1 М. Максимальную исходную концентрацию каждого тестируемого химического вещества, следует последовательно разбавлять в ДМСО (или другом растворителе) в соотношении 1:10. После добавления тестовых химикатов планшеты для анализа следует поместить при температуре плюс 37  1 °C в 5  0,5% CO2 инкубатор на 20 - 24 часа.
Максимальная концентрация испытуемого вещества в ходе предварительного скрининга должна быть серийно разведена в соотношении 1:3 или 1:5 в ДМСО. Эти разведения затем добавляют к водной среде до конечной концентрации ДМСО 0,1%, и все концентрации следует проверять в трех экземплярах
|
|
Анализ и интерпретация данных
|
Значения log PC10 и log PC50 могут быть определены как концентрации тестируемых химических веществ, которые, по оценкам, вызывают 10% или 50% индукцию транскрипционной активности, индуцированным контрольным агонистом андрогеновых рецепторов; 10 нМ дигидротестостерона). Значения log IC50 и log IC30 могут быть определены как концентрации тестируемых химических веществ, которые, по оценкам, вызывают либо 50%, либо 30% ингибирование транскрипционной активности, индуцированное 500 пМ дигидротестостерона. Положительная или отрицательная оценка испытуемого химического вещества должна основываться как минимум на двух или трех независимых испытаниях.
Для агонистов: испытуемое химическое вещество считается положительным, если RPCMax равна или превышает 10% реакции эталонного химического вещества по крайней мере в двух из двух или двух из трех экспериментов, тогда как испытуемое химическое вещество считается отрицательным, если RPCMax не удается достичь как минимум 10% отклика эталонного химического вещества в двух из двух или двух из трех прогонов.
Для антагонистов: химическое вещество считается положительным, если log IC30 можно рассчитать по крайней мере в двух из двух или двух из трех прогонов, тогда как испытуемое химическое вещество считается отрицательным, если log IC30 не может быть рассчитан в двух из двух или в двух из трех прогонов.
|
Критерии принятия решения: для агонистов - положительный, когда относительная индукция тестируемого вещества  10% для двух или более последовательных концентраций, отрицательный во всех остальных случаях.
Для антагонистов - положительный, когда относительная индукция испытуемого химиката составляет  80% для двух или более последовательных концентраций и (или) относительная индукция контроля нормализованной специфичности тестируемого химического вещества > 80% во всех концентрациях; или когда выполняются следующие два условия: относительная индукция нормализованного контроля специфичности тестируемого химического вещества в самой высокой концентрации  80%; квадрат коэффициента корреляции между относительной индукцией контроля нормализованной специфичности тестируемого химического вещества и относительной индукцией (R2  0,9), отрицательный - во всех остальных случаях.
|
В анализе агониста андрогеновых рецепторов необходимо предоставить следующую информацию о положительном химическом веществе: концентрации, которые вызывают эффект, соответствующий эффекту 10% для положительного контроля (log PC10) и, если применимо, 50% эффект для положительного контроля (log PC50). Значения log PC10 и log PC50 могут быть определены как концентрации химических веществ, которые вызывают 10% или 50% индукцию транскрипционной активности с помощью PCAGO1 (10 нМ дигидротестостерона). Для анализа антагониста андрогеновых рецепторов необходимо предоставить информацию для положительного химического вещества: концентрации для 30% ингибирования транскрипционной активности, индуцированной 800 пМ дигидротестостерона (log IC30) и, при необходимости, для 50% ингибирования активности 800 пМ дигидротестостерона (log IC50). Значения log IC50 и log IC30 могут быть определены как концентрации тестируемых химических веществ, которые вызывают либо 50%, либо 30% ингибирование транскрипционной активности, индуцированное 800 пМ дигидротестостерона. Для того чтобы химические вещества были истинными антагонистами андрогеновых рецепторов (конкурентными), рассчитывается квадрат коэффициента детерминации R2 между относительной индукцией стандартного ответа и относительной индукцией специфического ответа. Если R2 < 0,9, испытуемое вещество было признано истинным антагонистом андрогеновых рецепторов.
|