2.3. Лабораторные диагностические исследования

Лабораторные исследования направлены на оценку состояния и регуляции репродуктивной функции мужчин, выявление причин бесплодия, генетических аномалий. Проведение базовых (НМУ "Спермограмма"), расширенных и углубленных исследований эякулята в соответствии с методиками, описанными в руководстве ВОЗ [41] (определение антиспермальных антител в эякуляте, фрагментации ДНК сперматозоидов (ФДС), анеуплоидии сперматозоидов, соотношения гистонов и протаминов, оксидативного стресса, акросомальной реакции и др.) и других тестов, позволяет получить данные, свидетельствующие о функциональных характеристиках сперматозоидов и качества их генетического материала, что может помочь уточнить причину бесплодия, неудач лечения с применением ВМИ и ВРТ, невынашивания беременности. При этом при низких значениях числа, подвижности и доли нормальных форм сперматозоидов нередко выявляют более высокий уровень показателей, указывающих на их функциональную несостоятельность [42, 43].

Широкое распространение получила оценка антиспермальных антител и ФДС в эякуляте, однако, клиническую интерпретацию полученных результатов этих и других тестов затрудняет вариабельность исследуемых показателей, недостаточная стандартизация протоколов выполнения и отсутствие консенсуса в отношении референсных интервалов, которые в настоящее время каждой лаборатории предложено устанавливать самостоятельно [19, 44, 45, 46, 47].

Аутоиммунные реакции против сперматозоидов сопровождаются выработкой антиспермальных антител (АСАТ) Тест "Смешанная антиглобулиновая реакция сперматозоидов" (MAR-тест на наличие антиспермальных антител в сперме) относится к категории иммунологических, позволяет судить о наличии на поверхности сперматозоидов иммуноглобулинов IgA и IgG, снижающих фертильность. АСАТ в значениях выше 50% у мужчин с жалобами на бесплодие встречаются чаще, чем у фертильных - в 2,6% - 6% и 0,9% случаев соответственно, что можно объяснить их отрицательным влиянием на компоненты репродуктивной системы и этапы реализации репродуктивной функции: целостность мембран и ДНК, концентрацию и подвижность сперматозоидов, способность проникновения через цервикальную слизь, капацитацию, акросомную реакцию, взаимодействие с яйцеклеткой. Вероятность зачатия естественным путем от мужчин с результатами MAR-теста равными 100% оказалась существенно ниже тех, у кого его значение находится в диапазоне от 50% до 99% и составила 4,5% и 30,0% соответственно. Предложенное ранее значение MAR-теста 50% в качестве пороговой величины не позволило прогнозировать вероятность наступления естественной беременности, в связи с этим авторы руководства ВОЗ сообщили об отсутствии данных, позволяющих установить референсные значения MAR-теста для эякулята и отнесли его к группе расширенных методов исследования. Наличие антиспермальных антител не влияет на частоту наступления беременности при лечении по поводу бесплодия с применением ЭКО или ИКСИ [48, 49, 50, 51, 52, 53, 54].

К расширенным методам исследования эякулята также относятся тесты оценки ФДС. В патогенез появления разрывов ДНК сперматозоидов на клеточном уровне вовлечены механизмы апоптоза, нарушения созревания хроматина сперматозоидов и окислительного стресса. Более высоким уровням ФДС соответствуют меньшая вероятность наступления и последующего вынашивания беременности, а также зачатия и рождения ребенка после ВМИ и лечения с применением ВРТ. В настоящее время применяются несколько основанных на разных принципах методов определения этого показателя, мнения о преимуществах и недостатках каждого из них, а также о границах референсных интервалов полученных значений противоречивы, в профессиональных сообществах нет единой точки зрения о показаниях к проведению этого исследования (к ним относят наличие различных заболеваний, состояний и факторов, способных оказать негативное влияние на состояние репродуктивной функции, а также привычное невынашивание беременности и предшествующие неудачи лечения с применением ВРТ у супруги и др.). Методы лечения пациентов по поводу выявленных заболеваний и состояний, лечебные мероприятия, описанные в разделе 3, а также устранение факторов риска и сокращение периода воздержания позволяют уменьшить величину ФДС, отбор сперматозоидов с меньшим значением ФДС может быть проведен на этапе применения ВРТ, в том числе путем проведения биопсии яичек и ИКСИ [15, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64].

- Рекомендуется всем мужчинам с жалобами на бесплодие выполнять базовое исследование эякулята (спермограмму), включая определение объема эякулята, концентрации сперматозоидов, общего числа сперматозоидов, долей подвижных сперматозоидов (включая доли сперматозоидов с медленной и быстрой поступательной подвижностью), доли нормальных форм сперматозоидов и концентрации круглых клеток, а при значении доли подвижных сперматозоидов менее 40% - определение доли живых сперматозоидов, с целью определения показателей фертильности [3, 8, 31, 41].

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 5)

Комментарии: показатели эякулята являются высоко вариабельными как между разными мужчинами, так и у одного индивидуума, они также имеют региональные особенности. Результатов одного исследования эякулята может оказаться достаточно, чтобы получить представление о сперматогенезе и рекомендовать последующее обследование мужчины, для более полного понимания состояния репродуктивной функции может потребоваться анализ двух или трех образцов эякулята, для подтверждения азооспермии необходимо провести исследование не менее двух образцов. Минимальные референсные значения показателей эякулята (5-й процентиль), полученные в когортах фертильных мужчин по данным зарубежных и российских исследователей [36, 41], представлены в таблице 1.

Таблица 1. Минимальные референтные значения показателей эякулята фертильных мужчин (5-й процентиль)

Минимальные референсные величины показателей эякулята фертильных мужчин не имеют клинического значения, их нельзя рассматривать, как параметры границы между фертильными и бесплодными мужчинами. В связи с этим авторы руководства ВОЗ [41] отказались от использования при описании результатов тестов, проведенных при базовом исследовании эякулята, таких терминов как "нормозооспермия", "олигозооспермия", "астенозооспермия", "тератозооспермия", указывающих на соответствие или несоответствие этим величинам. Имеется связь вероятности зачатия с количеством, жизнеспособностью, подвижностью и морфологией сперматозоидов, наиболее информативным в отношении прогнозирования возможности зачатия естественным путем является показатель числа подвижных сперматозоидов: частота наступления беременности от мужчин, имевших менее 1 млн и от 1 до 5 млн подвижных сперматозоидов в эякуляте оказалась ниже по сравнению с теми, у кого этот показатель превышал значение 5 млн (отношения шансов составили 0,371 (0,215 - 0,64) и 0,505 (0,307 - 0,832 соответственно), а при значении более 50 млн вероятность наступления беременности в течение 5 лет оказалась выше на 45%, Показатель доли нормальных сперматозоидов не позволяет в отдельно взятом случае (за исключением 100% глобулозооспермии, синдрома ацефалических сперматозоидов и т.п.) прогнозировать наступление беременности и рождение ребенка [66, 67, 68, 69, 70, 71].

Необходимо предоставить мужчине четкие указания относительно сбора образца эякулята путем мастурбации. Прерванный половой акт не рекомендуется из-за риска неполного сбора и загрязнения влагалищным отделяемым и другими примесями. В исключительных случаях эякулят может быть получен при половом акте с использованием презерватива, не содержащего снижающих подвижность сперматозоидов веществ. При сборе эякулята следует избегать использования лубрикантов. Эякулят должен быть собран полностью, мужчину следует предупредить о том, что, если это не удалось, ему потребуется сообщить о потере какой-либо части образца. Целесообразно предложить мужчине собрать эякулят для анализа после периода воздержания, характерного для обычного ритма половой активности, однако, продолжительность этого периода не должна быть менее двух дней и более 7 дней. В случае если образец собран не в непосредственной близости от лаборатории, его следует транспортировать при температуре не ниже 20 °C и не выше 37 °C, исследование должно начаться в интервале 30 - 60 минут после сбора [72].

- Всем мужчинам, у которых при базовом исследовании эякулята выявлена концентрация круглых клеток, превышающая значение 1 x 10⁶ в мл, рекомендуется выполнить определение концентрации лейкоцитов в сперме с целью исключения инфекционно-воспалительных заболеваний органов репродуктивной системы [3, 46, 73, 74].

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 4)

Комментарии: при базовом исследовании эякулята невозможно достоверно идентифицировать среди круглых клеток лейкоциты и герминативные клетки. Увеличение числа лейкоцитов в сперме может быть одним из признаков инфекционно-воспалительного заболевания, снижающего репродуктивную функцию и требующего проведения дальнейшего обследования и лечения мужчины. [11, 75].

- При превышении уровня лейкоцитов в эякуляте пациентам рекомендуется микробиологическое (культуральное) исследование эякулята на аэробные и факультативно-анаэробные условно-патогенные микроорганизмы с целью исключения инфекционно-воспалительных заболеваний органов репродуктивной системы [76, 77].

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 4)

- При превышении уровня лейкоцитов в эякуляте пациентам рекомендуется молекулярно-биологическое исследование спермы на хламидии (Chlamidia trachomatis), молекулярно-биологическое исследование спермы на микоплазму хоминис (Mycoplasma hominis), молекулярно-биологическое исследование спермы на уреаплазму уреалитикум (Ureaplasma urealyticum) (НМУ - Молекулярно-биологическое исследование спермы на уреаплазмы (Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum), молекулярно-биологическое исследование спермы на гонококк (Neisseria gonorrhoeae), молекулярно-биологическое исследование спермы на трихомонас вагиналис (Trichomonas vaginalis) с целью выявления возбудителей урогенитальных заболеваний, способных негативно повлиять на состояние мужской репродуктивной функции [76, 77, 78, 79, 80, 231].

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 4)

Комментарии: уреаплазма парвум (Ureaplasma parvum) не связана с мужским бесплодием [79].

- Для исключения у пациента ретроградной эякуляции при азооспермии и объеме эякулята менее 1 мл рекомендуется микроскопическое исследование осадка мочи (исследование постэякуляторной мочи) [81, 82, 83].

Уровень убедительности рекомендаций B (уровень достоверности доказательств - 3)

- С целью диагностики гипогонадизма пациентам с азооспермией и олигозооспермией рекомендуется выполнять определение уровней гормонов - исследование уровня фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) в сыворотке крови и исследование уровня общего тестостерона крови [3, 84].

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 5)

Комментарии: забор крови для определения половых гормонов выполняют с 8.00 до 11.00. Исследование уровней ФСГ и лютеинизирующего гормона (ЛГ) в сыворотке крови, исследование уровня общего эстрадиола, пролактина и тиреотропного гормона в крови и прием (осмотр, консультация) врача-эндокринолога первичный показаны с целью уточнения эндокринных причин недостаточности репродуктивной функции и оценки возможности их устранения [85].

- Цитогенетическое исследование (кариотип) и прием (осмотр, консультация) врача-генетика первичный рекомендуются для выявления хромосомных аномалий пациентам с азооспермией и концентрацией сперматозоидов менее 10 млн/мл, при бесплодии неясного генеза, привычном выкидыше и повторных неудачах имплантации при лечении с применением ВРТ супруги (партнерши) [86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95].

Уровень убедительности рекомендаций B (уровень достоверности доказательств - 3)

Комментарии: нарушение сперматогенеза и мужской фертильности может быть обусловлено хромосомными аномалиями, наследственными заболеваниями, синдромальными и несиндромальными генетическими нарушениями, их частота наибольшая у пациентов с необструктивной азооспермией. В регуляцию сперматогенеза вовлечено большое количество генов, многие из которых, вероятно, еще не идентифицированы [96, 97]. У пациентов с олигозооспермией, связанной с генетическими нарушениями (включая робертсоновские и реципрокными транслокациями), может быть проведена криоконсервация сперматозоидов (НМУ - Криоконсервация гамет (ооцитов, сперматозоидов) для последующего лечения с применением ВРТ супруге (партнерше) в программе отложенного материнства [98].

- Молекулярно-генетическое исследование микроделеции локуса AZF Y-хромосомы (НМУ - Молекулярно-генетическое исследование микроделеций в Y хромосоме в крови) и прием (осмотр, консультация) врача-генетика первичный рекомендуется пациентам с азооспермией и концентрацией сперматозоидов менее 5 млн/мл), с целью выявления факторов риска развития генетических дефектов у потомства [3, 99].

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 5)

Комментарии: рекомендация относится к мужчинам, не имевшим более высокую концентрацию сперматозоидов в выполненных ранее анализах. Делеции AZF являются причиной нарушения сперматогенеза, их прогностическое значение при ТЕСЕ у мужчин с азооспермией связано с типом делеции: при полных делециях локусов AZFa и/или AZFb вероятность получения сперматозоидов хирургическим путем практически равна нулю. У пациентов с олигозооспермией может быть проведена криоконсервация гамет (сперматозоидов) для последующего применения ВРТ супруге (партнерше) в программе отложенного материнства [99]. Супружеская пара должна быть информирована о том, что микроделеции Y-хромосомы всегда наследуются сыновьями, их наличие может привести к снижению репродуктивной функции и бесплодию, а при лечении с применением ВРТ наблюдают низкие показатели оплодотворения, наступления беременности и рождения ребенка [100, 101, 102, 103], при этом частичные делеции региона AZFc (b2/b3, gr/gr и другие) были обнаружены у фертильных мужчин [104].

- Рекомендуется выполнить молекулярно-генетическое исследование мутаций в гене CFTR (муковисцидоз) в крови - пациентам с врожденным одно- и двусторонним отсутствием семявыносящих протоков, с клиническими признаками обструктивной азооспермии или при азооспермии неясного генеза с целью определения рисков развития генетических заболеваний у потомства [3, 11, 105].

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 5)

Комментарии: в случае выявления у мужчины мутации гена CFTR важно также рекомендовать его партнерше выполнить молекулярно-генетическое исследование мутаций в гене CFTR (муковисцидоз) и обратиться за консультацией к врачу-генетику. Выделено около 2000 мутаций, ответственных за развитие симптомов муковисцидоза, Согласно данным национального регистра в России наиболее часто встречаются следующие мутации: F508del (53,14%), CFTRdele2,3 (6,18%), E92K (3,11%), 3849 + 10kbC > T (2,29%), 2143delT (2,05%), 2184insA (1,88%), 1677delTA (1,76%), N1303K (1,69%), W1282X (1,63%), L138ins (1,46%), G542X (1,43%) [106] [1] Если окажется, что супруга (партнерша) является носителем такой же мутации в гене CFTR, то вероятность рождения ребенка с муковисцидозом или врожденной двусторонней аплазией семявыносящих протоков или других ассоциированных с муковисцидозом заболеваний может достигать 25 - 50% [99, 107]

- Рекомендовано выполнение исследования уровня антител классов M, G (IgM, IgG) к вирусу иммунодефицита человека ВИЧ-1/2 (далее - ВИЧ) и антигена p24 (Human immunodeficiency virus HIV 1/2 + Agp24) в крови, с целью подготовки к программе ВМИ и ВРТ по согласованию с врачом акушером-гинекологом, профилактики нежелательных событий ВМИ, ВРТ, профилактики распространения ВИЧ-инфекции [116, 117, 118].

Уровень убедительности рекомендаций A (уровень достоверности доказательств - 1)

Комментарии: согласно пункту 4.3. санитарно-эпидемиологических правил СП 3.1.5.2826-10 "Профилактика ВИЧ инфекции", стандартным методом лабораторной диагностики ВИЧ инфекции служит одновременное определение антител к ВИЧ 1,2 и антигена p24/25 ВИЧ с помощью диагностических тестов ИФА и ИХЛА [119]. При выявлении инфекции рекомендовано направить мужчину на прием (осмотр, консультация) врача-инфекциониста первичный в Центр по профилактике и борьбе со СПИДом и инфекционными заболеваниями для подтверждения/исключения диагноза. Обследование не требуется перед программой переноса криоконсервированного/размороженного эмбриона (ПРЭ).

- С целью подготовки к программе ВМИ и ВРТ по согласованию с врачом акушером-гинекологом, профилактики нежелательных событий ВМИ, ВРТ, профилактики распространения гепатита B, рекомендовано направить пациента на скрининговое обследование на гепатит B: определение антител к поверхностному антигену (HBsAg) вируса гепатита B (Hepatitis B virus) в крови или определение антигена (HbsAg) вируса гепатита B (Hepatitis B virus) в крови [120, 121, 122, 123, 124].

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 5).

Комментарии: при выявлении инфекции пациент направляется на прием (осмотр, консультацию) врача-инфекциониста первичный для подтверждения/исключения диагноза. Обследование партнера не требуется перед программой ПРЭ.

- С целью подготовки к программе ВМИ и ВРТ по согласованию с врачом-акушером-гинекологом, профилактики нежелательных событий ВМИ, ВРТ, профилактики распространения гепатита C рекомендовано направить пациента на скрининговое обследование на гепатит C - определение суммарных антител классов M и G (anti-HCV IgG и anti-HCV IgM) к вирусу гепатита C (Hepatitis C virus) в крови [120, 122, 123, 124].

Уровень убедительности доказательств рекомендаций C (уровень достоверности - 5)

Комментарий: при выявлении инфекции пациент направляется на прием (осмотр, консультацию) врача-инфекциониста первичный для подтверждения/исключения диагноза. Обследование партнера не требуется перед программой ПРЭ.

- С целью подготовки к программе ВМИ, ВРТ по согласованию с врачом акушером-гинекологом и профилактики нежелательных событий ВМИ, ВРТ рекомендовано направить мужчину на скрининговое обследование на сифилис (определение антител к бледной трепонеме (Treponema pallidum) в крови) в соответствии с действующими клиническими рекомендациями по заболеванию [125, 126].

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 4)

Комментарий: при выявлении инфекции пациент направляется на прием (осмотр, консультацию) врача-дерматовенеролога первичный для подтверждения/исключения диагноза. Обследование партнера не требуется перед программой ПРЭ.