III. Бактериологические методы определения сальмонелл

3.1. Эффективность проводимого бактериологического исследования, направленного на выделение сальмонелл из разных материалов, зависит от применения соответствующих сред обогащения и адекватного выбора дифференциально-диагностических сред (приложение 1 к настоящим МУ).

3.2. При исследовании различных материалов на инфицированность сальмонеллами отличаются только начальные этапы анализа (правила отбора материала, его обработка, выбор адекватных питательных сред). Начиная с отбора колоний на дифференциально-диагностических средах, последующие этапы бактериологического исследования идентичны.

3.3. Для проведения бактериологической диагностики сальмонеллеза используются культуральные среды, разрешенные к применению на территории Российской Федерации в установленном порядке <5>. Контроль питательных сред осуществляется в соответствии с методическими документами <6>.

--------------------------------

<5> Часть 4 статьи 38 Федерального закона от 21.11.2011 N 323-ФЗ "Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации" (далее - Федеральный закон от 21.11.2011 N 323-ФЗ); постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 N 1416 "Об утверждении Правил государственной регистрации медицинских изделий" (далее - постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 N 1416).

<6> Пункты 6.13, 7.2 МУК 4.2.2316-08 "Методы контроля бактериологических питательных сред", утвержденных руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 18.01.2008.

3.4. Среды обогащения делятся на неселективные первичные (забуференная пептонная вода) и среды селективного обогащения (бульон Раппапорт-Василиадиса с соей (англ. Rappaport Vassiliadis Soya, далее - RVS-бульон), модифицированный полужидкий агар Раппопорта-Василиадиса (англ. modified Semi-solid Rappaport-Vassiliadis, далее - MSRV-агар), тетратионатный бульон Мюллер-Кауфмана (англ. Muller-Kauffmann tetrathionate, далее - MKT-бульон), тетратионатно-новобиоциновый бульон Мюллер-Кауфмана (англ. Muller-Kauffmann tetrathionate-novobiocin, далее - MKTTn-бульон) магниевая, селенитовая).

3.5. Неселективное обогащение. Рекомендуемой средой для неселективного обогащения является забуференная пептонная вода с условиями инкубации: температура плюс (37 1) °C в течение (22 2) ч. Время инкубации при неселективном обогащении может зависеть от рекомендаций производителя забуференной пептонной воды.

3.6. Селективное обогащение. Необходимо минимизировать перенос частиц пробы из среды неселективного обогащения в две селективные среды обогащения. Основными средами для селективного обогащения являются RVS-бульон (0,1 мл суспензии образца добавляют в 10 мл среды обогащения и инкубируют при температуре плюс (41,5 1) °C в течение 24 - 48 ч) и MKT-бульон (1 мл суспензии образца добавляют в 10 мл среды обогащения и инкубируют при температуре плюс (37 1) °C в течение (22 2) ч). При отсутствии одной или обеих сред допускается замена на магниевую и (или) селенитовую среды. Для магниевой и селенитовой среды суспензию образца добавляют в соотношении 1:10 и инкубируют при температуре плюс (37 1) °C в течение (22 2) ч.

3.7. Наряду с использованием сред селективного обогащения, указанных в п. 3.6, возможно применение MSRV-агара и MKTTn-бульона. MSRV-агар предназначен для обнаружения подвижных бактерий рода Salmonella и не подходит для неподвижных штаммов Salmonella. MKTTn-бульон по сравнению с MKT-бульоном включает новобиоцин.

В качестве базовых сред можно применять комбинации сред RVS-бульона - MSRV-агара - MKTTn-бульона при исследовании пищевой продукции, предназначенной для употребления человеком и продукции для кормления животных, образцов окружающей среды из зоны прозводства и переработки пищевых продуктов, образцов, отобранных на стадии первичной переработки продовольственного сырья, таких как фекалии животных, пыль и смывы в соответствии с методическими документами <7>.

--------------------------------

<7> ISO 6579-1:2017 "Горизонтальный метод выявления, подсчета и определение серотипа бактерий рода бактерий рода Salmonella spp. Часть 1. Выявление бактерий рода Salmonella spp" (англ. "Horizontal method for the detection, enumeration and serotyping of Salmonella. Part 1: Detection of Salmonella spp.").

Для MSRV-агара в качестве посевного материала используют 0,1 мл суспензии образца после неселективного обогащения (см. п. 3.5). 0,1 мл суспензии образца вносят на поверхность MSRV-агара (в центральную часть чашки Петри) в виде одной - трех равноудаленных капель. Капли не должны растекаться по поверхности агара.

Засеянные чашки MSRV-агара инкубируют при температуре плюс (41,5 1) °C в течение (24 3) ч. Чашки MSRV-агара не переворачивают.

На чашках MSRV-агара, предположительно содержащих сальмонеллы, проявляется серо-белая мутная зона, выходящая за пределы инокулированной капли. На чашках MSRV-агара, не содержащих сальмонеллы, зона роста отсутствует или не выходит за пределы инокулированной капли.

При наличии роста на MSRV-агаре определяют самую дальнюю точку непрозрачного роста в местах иннокуляции и погружают 1 мм³ петлю непосредственно внутри границы непрозрачного роста. Петлю извлекают, убедившись, что не извлекаются большие куски MSRV-агара. Делают высев на дифференциально-диагностические среды (п. 3.12).

3.8. Для нивелирования изменений в концентрации компонентов селективной среды обогащения при разбавлении анализируемой пробой используют посев пробы в среду обогащения двойной концентрации в соотношении объемов пробы и среды 1:1.

3.9. Дифференциально-диагностические среды делятся на слабоселективные и высокоселективные. К первым относятся питательная среда Эндо, Агар МакКонки, Агар с бриллиантовым зеленым. Ко вторым - Бактоагар Плоскирева, Сальмонелла-шигелла агар (англ. Salmonella Shigella Agar, далее - SS-агар), ксилозо-лизин-дезоксихолатный агар (англ. xylose lysine deoxycholate agar, далее - XLD-агар, Рамбах агар, Висмут-сульфит агар, Гектоен-агар. Характер роста сальмонелл на указанных средах приведен в табл. 3.1.

Таблица 3.1

Характер роста сальмонелл на различных

дифференциально-диагностических средах

3.10. Перед использованием плотные питательные среды подсушивают, на их поверхности не должна оставаться конденсационная жидкость.

3.11. Параллельно с высевом биологического материала на среды обогащения можно проводить прямой посев материала на плотные дифференциально-диагностические среды (приложение 2 к настоящим МУ). При посеве на плотные среды исследуемый материал наносят с помощью бактериологической петли, стерильного ватного тампона, пипетки, стеклянной палочки, затем при помощи бактериологической петли рассевают истощающим штрихом до изолированных колоний.

3.12. В качестве дифференциально-диагностических сред рекомендуется использовать XLD-агар в комбинации с агаризованной селективной средой. XLD-агар инкубируют при температуре плюс (37 1) °C в течение (22 2) ч. Второй селективный агар инкубируют в соответствии с инструкциями производителя. Высев на дифференциально-диагностические среды делают таким образом, чтобы получить хорошо изолированные колонии.