7.3.1. Определение O- и H-антигенов, выделенных сальмонелл

7.3.1.1. Определение O- и H-антигенов проводится в реакции агглютинации на стекле.

Диагностические агглютинирующие адсорбированные сыворотки содержат антитела к O- и H-антигенам сальмонелл, которые образуют агглютинат с бактериями, обладающими соответствующими антигенами.

7.3.1.2. Растворять сухие сальмонеллезные O- и H-сыворотки следует в 1,0 мл изотонического раствора хлорида натрия (или 2,0 мл) в соответствии с инструкцией изготовителя.

7.3.1.3. На предметное стекло наносится одна капля сыворотки и одна капля изотонического раствора хлорида натрия. С питательного агара берется полная петля культуры, выращенной при температуре плюс (37 1) °C в течение (22 2) часов. Культура наносится на предметное стекло вблизи капли изотонического раствора хлорида натрия и эмульгируется (контроль на отсутствие спонтанной агглютинации). При отсутствии спонтанной агглютинации манипуляцию повторяют в капле O- и H-сыворотки, формируя равномерную непрозрачную суспензию. Учет результатов проводят в течение 1 - 2 минут, мягко покачивая стекло. Агглютинация проявляется через несколько секунд (или 1 минуту) в виде хлопьев (зерен) агглютината, формирующихся внутри капли на фоне ее просветления. Образование хлопьев агглютината внутри капли расценивается как положительный результат. Гомогенная суспензия свидетельствует об отрицательном результате. Штаммы, находящиеся в R-форме, обладают самопроизвольной агглютинацией. Их дальнейшее серотипирование не представляется возможным без дополнительных манипуляций. Такие штаммы пересевают на слабощелочной агар для того, чтобы выбрать колонию с ровными краями и вернуть штамм в S- (гладкую) форму и повторить агглютинацию. Результаты определения O- и H-антигенов штамма фиксируются в протоколе лабораторных исследований.

7.3.1.4. Если агглютинация с поливалентными O-сыворотками не происходит, а по биохимическим свойствам культура соответствует роду Salmonella, такой штамм направляется в Референс-центр по мониторингу за сальмонеллезами ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора <25> (далее - Референс-центр).

--------------------------------

<25> Приказ Роспотребнадзора от 01.12.2017 N 1116 "О совершенствовании системы мониторинга, лабораторной диагностики инфекционных и паразитарных болезней и индикации ПБА в Российской Федерации" (далее - Приказ Роспотребнадзора от 01.12.2017 N 1116).

7.3.1.5. Для реакции агглютинации с O-сывороткой следует брать культуру с верхней части скошенного агара, для H-сывороток - конденсат или с нижнего участка роста (наиболее подвижные бактерии).

7.3.1.6. Серологическую идентификацию сальмонелл начинают с испытания их в реакции агглютинации на стекле с агглютинирующей адсорбированной поливалентной сывороткой к сальмонеллам групп A, B, C, Д, E, а в случае получения отрицательного результата с агглютинирующей адсорбированной поливалентной сывороткой к сальмонеллам редких групп (F-67).

7.3.1.7. При получении положительных результатов агглютинации со смесью O-сывороток культуру испытывают с каждой O-сывороткой (входящей в смесь) по отдельности. После установления принадлежности культуры к одной из O-групп выявляют наличие дополнительных O-антигенов, присущих представителям указанной группы.

7.3.1.8. Для определения H-антигенов используют ту же культуру, выросшую на питательном агаре. Для исследования берут полную петлю культуры из суспензии, образованной путем смеси культуры и конденсата внутри пробирки со скошенным агаром. Вначале используют H-сыворотки, соответствующие H-антигенам 1 фазы, а затем H-антигенам 2 фазы. Начинать следует с H-сывороток, соответствующих более распространенным сероварам данной группы.

7.3.1.9. Образование хлопьев агглютината внутри капли расценивается как положительный результат. Гомогенная суспензия свидетельствует об отрицательном результате. Если культура малоподвижна, можно применять полужидкий (0,7%) агар, условно называемый агаром для роения. В центр чашки добавляют 0,1 мл изотонического раствора хлорида натрия и вносят петлю исследуемой культуры. Посев инкубируют (22 2) ч при температуре плюс (37 1) °C.

7.3.1.10. В случае отсутствия реакции агглютинации с сыворотками одной из H-фаз проводят инверсию (подавление) обнаруженной H-фазы (метод Свена-Гарда). Для определения не выявленного H-антигена готовят чашки Петри с полужидким (0,7%) агаром. После застывания агара в центр чашки добавляют 0,1 мл сыворотки против выявленного H-антигена первой или второй фазы, а затем в центр капли петлей наносят культуру. Вместо чашки можно использовать U-образную трубку. Инкубировать посев (22 2) ч при температуре плюс (37 1) °C (чашки не переворачивать).

7.3.1.11. Соответствующая сыворотка (антитела) связывает выявленный H-антиген, подвижность (роение) штамма будет происходить за счет клеток, содержащих H-антиген не обнаруживаемой фазы. Неизвестная фаза H-антигена определяется тем же способом, что и выявленная. При этом культура берется с периферии выросшей макроколонии или с противоположного относительно посеву колена U-образной трубки.

7.3.1.12. После суммирования результатов O- и H-серотипирования определяется серовар штамма согласно в соответствии со схемой Кауфмана-Уайта (см. приложение 5 к настоящим МУ).