2.3 Лабораторные диагностические исследования

- Рекомендуется использовать для лабораторной диагностики только образцы жидкого стула (по Бристольской шкале 6 - 7, см. Приложение Г1 Шкалы) у пациентов с впервые возникшей в течение 24 часов диареей ( 3 эпизодов в стуки) неясного генеза для тестирования на клостридиальную инфекцию [5, 10, 25, 27].

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 5)

Комментарии: если у пациента наблюдается диарея, которая не может быть полностью объяснена наличием сопутствующего заболевания (ВЗК) или проводимым лечением (энтеральное зондовое питание, химиотерапия, прием слабительных средств) целесообразно проводить лабораторное обследование на наличие C. difficile. Исследование показано при сохранении симптомов на фоне отмены терапии (например, препаратов для химиотерапии, слабительных средств) или энтерального зондового питания [10, 25]. Пациентам с кишечной непроходимостью рекомендуется проводить исследование образцов ректального мазка [5, 27].

- Не рекомендуется проводить лабораторное обследование на наличие C. difficile пациентам без диареи (бессимптомным) для предотвращения гипердиагностики и последующего необоснованного лечения [5].

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 5)

Комментарии: целесообразно обследовать на клостридиальную инфекцию пациентов без диареи, за исключением тестирования пациентов перед госпитализацией в онкологический стационар или отделение трансплантологии с целью инфекционного контроля [27].

- Рекомендуется проводить не менее 2-х методов лабораторного тестирования образцов стула у пациентов с диареей неясного генеза для диагностики клостридиальной инфекции [5, 8, 10, 21, 25, 27, 29, 30].

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 5)

Комментарии: для диагностики диффициального клостридиоза используются культуральные, молекулярно-генетические и иммунологические тесты, позволяющие определить наличие C. difficile в кале посредством выявления самого возбудителя, его антигенов, токсинов или фермента глутаматдегидрогеназы (ГДГ).

Культуральный метод позволяет определить наличие вегетативных клеток или спор C. difficile, оценить цитотоксичность C. difficile с использованием реакции нейтрализации на культуре клеток и определить чувствительность к антибактериальным препаратам. (Таблица 2).

При помощи ПЦР (полимеразная цепная реакция) можно обнаружить ДНК возбудителя, гены, кодирующие ГДГ, а также токсины A, B и бинарный токсин, тем самым подтверждая наличие токсигенного штамма C. difficile.

Иммунологический метод ИХА (иммунохроматографический анализ), используется для детекции антигенов токсинов A и B C. difficile.

Таблица 2. Методы диагностики C. difficile [8, 10, 25, 26, 27, 29, 30].

В настоящее время считается, что ни один из доступных лабораторных тестов не подходит в качестве отдельного метода диагностики энтероколита, вызванного C. difficile. Каждый из них имеет свои особенности в проведении и интерпретации результатов, а также разную чувствительность, специфичность, и, соответственно, прогностическую ценность (Таблица 3). Культуральный метод является трудоемким, длительным в исполнении, может проводиться только в хорошо оснащенных лабораториях квалифицированным персоналом и, несмотря на надежность, редко используются в рутинной практике [8, 10]. Определение ДНК возбудителя диффициального клостридиоза (Clostridium difficile) в образцах фекалии методом ПЦР обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Данный тест позволяет подтвердить наличие C. difficile, но имеет ограничения в использовании, а именно высокую стоимость и трудности в интерпретации результатов. Данный метод является качественным (положительный или отрицательный) и не может характеризовать бактериальную нагрузку и жизнеспособность C. difficile. Выявления генов, кодирующих токсины, не всегда означает, что штамм продуцирует их в данный момент. Если диарея имеет другое происхождение, обнаружение такого штамма может ввести врача в заблуждение [5, 8, 27, 29]. Наиболее распространенным методом в настоящее время считается иммунохроматографическое исследование кала на токсины A и B Clostridium difficile ввиду низкой стоимости и простоты выполнения. Недостатком является высокий уровень ложноположительных результатов и межлабораторных различий. Результаты ИХА на токсины C. difficile могут быть отрицательными на ранних стадиях (из-за невысокой бактериальной нагрузки), а также и у пациентов с осложненным течениям заболевания. При исследовании образца стула иммунологическими методами следует соблюдать правила транспортировки и хранения. После получения образца стула его следует хранить при температуре + 4 °C (в холодильнике) и использовать для тестирования в течение следующих 24 часов, поскольку токсин, быстро разрушается при комнатной температуре, и примерно через 2 часа его нельзя обнаружить в полученном материале [5, 8, 10, 25, 27, 29]. Определить наличие ГДГ в стуле также возможно с использованием иммунологических методов, однако это не позволяет дифференцировать наличие у пациента именно токсигенного штамма, так как ГДГ это фермент, продуцируемый, в том числе, нетоксигенными штаммами. Ввиду этого данный тест рекомендован только в качестве скрининга.

Разработаны коммерческие ИХА тест-системы для экспресс-анализа в виде пластиковых пластин с окнами для внесения материала, учета результата и контроля, позволяющие определить не только наличие ГДГ в стуле, но также токсинов A и B. Данные тесты просты в использовании, позволяют быстро получить результат и не требуют специально обученного медицинского персонала, но по чувствительности уступают другим методам иммуноанализа и нет четких критериев для интерпретации данных [5, 8, 10, 27, 30, 31]. В настоящее время в России по данным государственного реестра медицинских изделий и организаций (индивидуальных предпринимателей), осуществляющих производство и изготовление медицинских изделий (www.roszdravnadzor.gov.ru) зарегистрирован 1 набор реагентов (экспресс-тест) для определения антигенов C. difficile ГДГ + токсина A + токсина B в образцах кала методом ИХА, 2 набора реагентов (экспресс-тест) для определения антигенов токсина A + токсина B в образцах кала методом ИХА, 4 набора реагентов для диагностики in vitro токсинов A и B методом ИФА, 1 набор реагентов для диагностики in vitro токсинов A и B с помощью ПЦР-анализатора. Также зарегистрированы питательные среды, добавки и компоненты питательных сред для микробиологической диагностики C. difficile.

Таблица 3. Характеристики методов, использующихся для диагностики C. difficile [8, 10, 26, 27, 29, 31].

- Рекомендуется использовать двухступенчатый алгоритм лабораторной диагностики образцов стула у пациентов с диареей и наличием факторов риска клостридиальной инфекции для увеличения диагностической ценности положительного результата лабораторного тестирования [5, 8, 10, 21, 25, 27, 29, 30].

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 5)

Комментарии:

В качестве первичной ступени/скрининга рекомендуется определение ДНК C. difficile (ПЦР) или, при возможности, ГДГ (ИХА, ИФА, ПЦР). В случае отрицательных тестов клостридиальная инфекция исключается, дальнейшее исследование прекращается. При получении положительного результата следующим этапом рекомендуется провести тест для определения токсинов A и B (ИХА или ИФА). Положительный результат второго теста подтверждает наличие клостридиальной инфекции. В случае отрицательного результата второго теста необходима тщательная клиническая оценка, поскольку такая лабораторная картина может быть в трех ситуациях: C. difficile с уровнем токсина ниже порога обнаружения, ложноотрицательный результат ИХА или ИФА на токсины A и B или носительство C. difficile. Образцы стула с отрицательным результатом на наличие ГДГ, но с положительным результатом на наличие токсинов должны быть протестированы повторно, так как данный результат недействителен (см. Приложение Б) [5,27].

- Не рекомендуется проводить повторное тестирование образцов стула у пациентов с диареей и первично отрицательным результатом лабораторного тестирования, выполненного для диагностики клостридиальной инфекции [5, 8, 10, 25].

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 5)

Комментарии: повторное тестирование в течение 7 дней после первоначального отрицательного результата не рекомендуется из-за высокого риска ложноположительных результатов, очень низкой диагностической ценности (2%) и вероятности ненужного лечения [5, 8, 10, 25]. Повторное тестирование на наличие C. diffiicle можно рассматривать только в случае ухудшения состояния пациентов с характерной клинической картиной и отрицательными результатами первичного лабораторного тестирования [10].

- Рекомендуется выполнить стандартные лабораторные тесты, включающие общий клинический анализ крови (с определением СОЭ и лейкоцитарной формулой), анализ крови биохимический общетерапевтический с определением уровня маркеров системного воспалительного ответа (С-реактивный белок, ферритин), альбумина, креатинина, электролитов (калий, натрий, кальций, хлориды), общий анализ мочи, копрограмму у пациентов при подозрении на клостридиальный колит для определения степени тяжести и выявления осложнений [32, 33]

Уровень убедительности рекомендаций С (уровень достоверности доказательств - 5)

Комментарии: в зависимости от степени тяжести и наличия осложнений в общем (клиническом) анализе крови может наблюдаться повышение уровня лейкоцитов (лейкоцитоз), в анализе крови биохимическом общетерапевтическом - повышение уровня С-реактивного белка, гипоальбуминемия, маркеры острого почечного повреждения. В случае легкого/ умеренной тяжести течения энтероколита, вызванного C. difficile, в анализах крови может наблюдаться лейкоцитоз до 15 x 10⁹/л, уровень креатинина не более 1,5 мг/дл. При тяжелом/ осложненном течении заболевания в общем (клиническом) анализе крови признаки лейкоцитоза (более 15 x 10⁹/л), в анализе крови биохимическом общетерапевтическом могут быть выявлены признаки нарушения функции органов-мишеней, а именно повышение креатинина более 1,5 мг/дл или более чем в 1,5 раза выше исходного уровня. У таких пациентов могут определяться признаки нарушения электролитного баланса, гиповолемии, признаки лактоацидоза. В случае развития осложнений также повышаются маркеры системного воспаления (СРБ), развивается гипоальбуминемия. При развитии гипотензии могут наблюдаться признаки дисфункции органов-мишеней, вторичных по отношению к гипоперфузии, например, повышение печеночных ферментов [10, 25, 27].

- Рекомендуется исследования коагулограммы у пациентов с энтероколитом, вызванным C. difficile, для оценки риска осложнений, связанных с нарушением свертываемости крови [34]

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 5)

Комментарии: C. difficile является наиболее распространенной госпитальной инфекцией, характеризующейся повышенной частотой осложнений, связанных с нарушением свертываемости крови, таких как тромбоз глубоких вен (ТГВ) и диссеминированное внутрисосудистое свертывание крови (ДВС), а также значительной смертностью, связанной с сепсисом [34]

- Рекомендуется исключить другие инфекционные причины энтероколита (вирусы, бактерии) у пациентов с подозрением на клостридиальную инфекцию, как с позиции тактики лечения, так и снижения риска заноса возбудителя инфекционных болезней в медицинскую организацию [32, 35]. Рекомендуется у пациентов с признаками ОКИ проведение этиологической диагностики, направленной на установление вирусной, бактериальной или сочетанной этиологии заболевания: молекулярно-биологическое исследование фекалий на ротавирусы (Rotavirus gr. A), определение РНК ротавирусов (Rotavirus gr. A) в образцах фекалий методом амплификации нуклеиновых кислот (ПЦР), молекулярно-биологическое исследование фекалий на норовирусы (Norovirus II, I генотипа), определение РНК норовирусов (Rotavirus gr. A) в образцах фекалий методом амплификации нуклеиновых кислот (ПЦР); молекулярно-биологическое исследование фекалий на микроорганизмы рода сальмонелла (Salmonella spp.); молекулярно-биологическое исследование фекалий на микроорганизмы рода шигелла (Shigella spp.); молекулярно-биологическое исследование фекалий на диарогенные эшерихии (ЕНЕС, ЕРЕС, ETEC, EAgEC, EIEC); Молекулярно-биологическое исследование фекалий на патогенные кампилобактерии (Campylobacter jejuni/coli). [35]

Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств - 5)

Комментарии: Молекулярно-биологическое исследование фекалий на наличие РНК/ДНК ведущего спектра возбудителей ОКИ характеризуется высокой чувствительностью (более 90%) и специфичностью (более 95%), позволяет существенно сократить время установления этиологического диагноза, определения тактики этиотропной терапии и проведения противоэпидемических мероприятий в очаге (в случае регистрации очаговой заболеваемости) Поскольку клинические симптомы инфекций, вызванных различными энтеропатогенами, в значительной степени совпадают, сложно дифференцировать этиологию диареи у пациентов на этапе первичного обращении за медицинской помощью. Эта проблема также относится к диагностике инфекции C. difficile, которая может вызывать как легкую диарею, так и тяжелый псевдомембранозный колит. Результаты обследования больных с диареей, обратившихся в отделение неотложной помощи с использованием вирусной и бактериальной кишечной панели ПЦР, ПЦР на C. difficile позволили выявить наряду с C. difficile (20% пациентов) целый спектр классических возбудителей инфекционной диареи (Campylobacter spp. Salmonella spp.; энтеротоксигенная Е. Coli; Shigella spp., ротавирус, норовирус и др.) [35].