III. Описание метода

3.1. Метод ПЦР способен идентифицировать возбудителей инфекционных болезней на основе выявления их генетического материала (ДНК или РНК) в пробах, полученных от обследуемого человека.

Анализ исследуемых образцов включает этапы обратной транскрипции (ОТ) РНК, выделенной из клинического материала, амплификации специфических фрагментов комплементарной ДНК (кДНК) SARS-CoV-2 в ходе ПЦР и детекции продуктов амплификации в режиме реального времени. Для оценки проведения ПЦР отдельно используются положительный контроль ПЦР (далее - К+) и отрицательный контроль ПЦР (далее - К-). Реакция ОТ проводится с целью образования кДНК на матрице РНК с дальнейшим выявлением специфического фрагмента вируса и накоплением продукта амплификации в ходе ПЦР путем детекции флуоресценции, испускаемой флуоресцентно-меченым гидролизным зондом. Начало флуоресценции и интенсивность количественно зависят от концентрации детектируемого фрагмента кДНК в образце. Для амплификации специфического участка кДНК используются олигонуклеотиды, для детекции накопления специфического продукта используются флуоресцентно-меченые олигонуклеотидные зонды. Состав набора реагентов для определения сублиний геноварианта "Омикрон" SARS-CoV-2 содержит олигонуклеотиды и флуоресцентно-меченые олигонуклеотидные зонды, специфичные к каждому варианту "Омикрона" в соответствии с характерными для них мутациями, и позволяющие проводить регистрацию флуоресценции по разным каналам детекции JOE/HEX и FAM для каждого типа.

Учет результатов и установление наличия РНК вируса SARS-CoV-2 производится путем анализа данных о пороговом цикле флуоресценции (Ct) образца, показывающем обратную зависимость значения цикла пороговой флуоресценции от количества целевой РНК в пробе. Наименьшее значение циклов соответствует максимальной концентрации РНК вируса. Постановку ПЦР проводят на амплификаторах с функцией детекции флуоресценции в режиме реального времени по каналам FAM/Green и HEX/Orange планшетного (например, CFX96) или роторного типа (например, Rotor-Gene 3000/6000 или Rotor-Gene Q).

Цикличность ПЦР достигается путем многократного (от 40 до 45 раз) последовательного повторения шагов инкубации реакционной смеси при температурах: плюс 95 °C (денатурация ДНК/кДНК), плюс 55 °C (отжиг праймеров и элонгация цепи ДНК).

3.2. Исследование методом ПЦР состоит из следующих этапов:

- экстракция нуклеиновых кислот (далее - НК) из образцов исследуемого биологического материала (экстракция НК может проводиться различными способами, включая автоматизированные);

- получение кДНК на матрице РНК вируса в реакции ОТ в условиях одной пробирки с последующим проведением ПЦР;

- амплификация кДНК при помощи специфичных к выбранным мутациям праймеров в присутствии флуоресцентно меченных зондов, специфичных для определяемых мутаций SARS-Cov-2;

- анализ и интерпретация результатов.

3.3. Выбор, отбор, хранение и использование биологического материала осуществляется в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <2> и методическими документами <3>.

--------------------------------

<2> Глава IV СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней", утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 N 4 (зарегистрировано Минюстом России 15.02.2021, регистрационный N 62500), с изменениями, внесенными постановлениями Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 11.02.2022 N 5 (зарегистрировано Минюстом России 01.03.2022, регистрационный N 67587); от 25.05.2022 N 16 (зарегистрировано Минюстом России 21.06.2022, регистрационный N 68934) (далее - СанПиН 3.3686-21); главы II, III СП 3.1.3597-20 "Профилактика новой коронавирусной инфекции (COVID-19)", утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 22.05.2020 N 15 (зарегистрировано Минюстом России 26.05.2020, регистрационный N 58465), с изменениями, внесенными постановлениями Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 13.11.2020 N 35 (зарегистрировано Минюстом России 16.11.2020 N 60909); от 11.10.2021 N 25 (зарегистрировано Минюстом России 14.10.2021, регистрационный N 65406); от 09.11.2021 N 29 (зарегистрировано Минюстом России 12.11.2021, регистрационный N 65801); от 04.12.2021 N 33 (зарегистрировано Минюстом России 06.12.2021, регистрационный N 66208); от 21.01.2021 N 2 (зарегистрировано Минюстом России 25.01.2022, регистрационный N 66988); от 28.01.2022 N 3 (зарегистрировано Минюстом России 22.02.2022, регистрационный N 67407); от 04.02.2022 N 4 (зарегистрировано Минюстом России 04.02.2022, регистрационный N 67165); от 20.06.2022 N 18 (зарегистрировано Минюстом России 01.07.2022, регистрационный N 69091).

<3> МУ 1.3.2569-09 "Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I - IV групп патогенности", утвержденные Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 22.12.2009 (далее - МУ 1.3.2569-09); МР 3.1.0272-22 "Молекулярно-генетический мониторинг штаммов возбудителя новой коронавирусной инфекции", утвержденные руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 10.01.2022.

3.4. ПЦР-исследования проводятся в лицензированных организациях, имеющих разрешение на деятельность, связанную с возбудителями инфекционных заболеваний <4>, а также в лабораториях, имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение <5>.

--------------------------------

<4> Постановление Правительства Российской Федерации от 01.06.2021 N 852 "О лицензировании медицинской деятельности (за исключением указанной деятельности, осуществляемой медицинскими организациями и другими организациями, входящими в частную систему здравоохранения, на территории инновационного центра "Сколково") и признании утратившими силу некоторых актов Правительства Российской Федерации".

<5> Глава IV СанПиН 3.3686-21.

3.5. Методика скрининга предназначена для качественного определения РНК геноварианта SARS-CoV-2 "Омикрон" методом ОТ-ПЦР и позволяет дифференцировать сублинии BA.1*, BA.2* в ходе проведения оперативного молекулярно-эпидемиологического мониторинга с целью идентификации и типирования вируса.