VII. Проведение исследования

7.1. Использование набора реагентов подразумевает работу с готовыми образцами РНК, выделенными из клинического материала.

7.2. В рабочей зоне 3 размораживаются при температуре от плюс 20 до плюс 25 °C следующие компоненты набора: Amp 1B, Amp 1RT, Amp 2 Omicr, К+ Omicr, К-, а также образцы исследуемого материала, если они хранились в замороженном состоянии (от минус 18 до минус 25 °C). Алгоритм проведения исследования описан в п. 7.2.1 - 7.2.12.

7.2.1. Необходимо рассчитать объем компонентов для общей реакционной смеси, исходя из количества исследуемых образцов. Учесть необходимость постановки положительных и отрицательных контролей реакции К+, К- (табл. 1).

7.2.2. Содержимое пробирок тщательно перемешивается четырехкратным переворачиванием, затем встряхиванием на вортексе, не допуская образования пены; осадить капли в микроцентрифуге в течение 5 с.

Таблица 1

Компоненты реакционной смеси

7.2.3. Приготовить общую реакционную смесь и тщательно перемешать встряхиванием на вортексе; осадить капли со стенок пробирок в микроцентрифуге в течение 5 с.

7.2.4. Подготовить пробирки/стрипы/планшет для ПЦР (в зависимости от числа проб и типа амплификатора): установить в штатив, промаркировать, надписи должны быть минимальными, не использовать маркер, который флуоресцирует при возбуждении светом, избегать надписей на поверхностях пластика, задействованных в детекции флуоресценции.

7.2.5. Внести по 15 мкл общей реакционной смеси во все пробирки (лунки) для ПЦР в соответствии с числом исследуемых проб.

7.2.6. Подготовить контрольные и исследуемые образцы РНК. После размораживания контрольные и исследуемые образцы центрифугировать в микроцентрифуге в течение 5 с для осаждения капель со стенок и крышки.

7.2.7. Добавить 10 мкл К- в пробирки для ПЦР, соответствующие отрицательным контрольным образцам ПЦР.

7.2.8. Добавить по 10 мкл РНК исследуемых образцов в соответствующие пробирки для ПЦР.

7.2.9. Добавить 10 мкл К+ в пробирки для ПЦР, соответствующие положительным контрольным образцам этапа ПЦР.

7.2.10. Закрыть крышки пробирок для ПЦР; осадить капли центрифугированием в микроцентрифуге в течение 10 с.

7.2.11. Пробирки с внесенными исследуемыми образцами, К+ и К- установить в блок амплификатора.

7.2.12. Запустить программное обеспечение амплификатора. Открыть созданный ранее шаблон или ввести параметры ПЦР в зависимости от типа амплификатора для ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) (табл. 2), создать разметку плашки в соответствии с установленными пробирками в блок амплификатора, выбрать каналы детекции FAM и JOE/HEX, запустить программу амплификации.

Таблица 2

Условия проведения амплификации и детекции результатов