2.3 Лабораторные диагностические исследования

Лабораторная диагностика при неонатальном скрининге включает определение в сухом пятне крови концентрации общей галактозы, при положительном результате - определение активности фермента ГАЛТ и мутаций в гене GALT ("исследование уровня галактозы в крови", "комплекс исследований для диагностики галактоземии"). Если диагностика проводится у пациента с уже выявленными клиническими симптомами, на фоне диетотерапии, инфузионной терапии, тактика лабораторного исследования может включать определение активности фермента ГАЛТ или только проведение ДНК-диагностики. После исключения ГАЛ I у пациентов с высоким уровнем галактозы следует проводить исследования для исключения других форм ГАЛ.

Исследование активности ГАЛТ не следует проводить в течение 1 месяца после переливания эритроцитарной массы т.к. исследование фермента осуществляется в эритроцитах.

- Рекомендуется проведение неонатального скрининга на наследственные заболевания всем новорожденным для выявления наследственных нарушений метаболизма галактозы [1 - 7].

Уровень убедительности рекомендаций - C (уровень достоверности доказательств - 4)

Комментарии: в соответствии с приказом Минздрава России N 274н от 21.04.2022 года "Об утверждении Порядка оказания медицинской помощи пациентам с врожденными и (или) наследственными заболеваниями", в Российской Федерации массовый неонатальный скрининг на галактоземию производят через 3 часа после кормления в возрасте 24 - 48 часов жизни у доношенного и на 7-е сутки (144 - 168 часов) жизни у недоношенного. Образец крови (несколько капель) берут из пятки новорожденного на специальный фильтровальный тест-бланк. При помощи флуоресцентного метода в пятнах высушенной крови проводят определение уровня тотальной галактозы (03.E04.01.005.000 Исследование галактозы в сухом пятне крови), который представляет собой сумму концентрации галактозы и галактозо-1-фосфата. Оценка результатов неонатального скрининга на ГАЛ представлены в Приложении Г1.

- Рекомендуется исследование уровня галактозы в крови (при неонатальном скрининге и/или при установлении диагноза, и/или при диспансерном наблюдении) всем новорожденным и/или пациентам с клиническими признаками и/или подтвержденным диагнозом ГАЛ для диагностики наследственных нарушений метаболизма галактозы/контроля состояния и лечения при подтвержденном диагнозе [1 - 11, 27, 28].

Уровень убедительности рекомендаций - C (уровень достоверности доказательств - 4)

- Рекомендуется комплекс исследований для диагностики галактоземии (при установлении диагноза и/или при снижении активности фермента галактозо-1-фосфатуридилтрансферазы) всем пациентам при выявлении уровня тотальной галактозы выше уровня отрезной точки (cut-off) [8, 9, 10, 11, 27, 28].

Уровень убедительности рекомендаций - C (уровень достоверности доказательств - 4)

Комментарий: подтверждающая диагностика на первом этапе включает определение активности фермента ГАЛТ [8, 9, 10, 11, 27, 28]. Отрезные точки при определении уровня тотальной галактозы в разных странах варьируют от 7 до 20 мг/дл. В РФ нет документа, регламентирующего критические значения этого показателя. Каждая лаборатория должна установить свой собственный рабочий диапазон и пороговый уровень этого показателя. Определение активности фермента ГАЛТ проводится в эритроцитах, полученных из гепаринизированной цельной крови или в пятнах высушенной крови. У пациентов с ГАЛ I, которым было проведено переливание эритроцитарной массы, активность ГАЛТ сохраняется течение 4 месяцев после переливания, что является причиной ложноотрицательных результатов. Референсные значения определяются набором производителя [27].

Фермент ГАЛТ стабилен в цельной крови, хранящейся в холодильнике (+4 °C) или при комнатной температуре в течение 2 недель; однако существуют определенные нуклеотидные варианты, в том числе и вариант Дуарте (p.N314D), при наличии которых образуется более термолабильный белок по сравнению с нормой, что может приводить к ложноположительным результатам тестирования [28].

Снижение активности ГАЛТ на <= 10% от нормы обычно является диагностическим признаком классической галактоземии (Приложение Г1). Активность ГАЛТ пациентов с галактоземией Дуарте (G/D) составляет примерно 25% от контроля, в то время как активность гетерозигот для классической ГАЛ (G/N), гомозигот по варианту Дуарте (D2/D2) или ГАЛ с вариантом LA (D1/G) составляет примерно 50% от нормальной активности. Гетерозиготы по аллелю Дуарте (D2) обычно обладают 75% нормальной ферментативной активности и не всегда могут отличаться от нормальных контролей или носителей исключительно на основе активности фермента. Носители варианта Лос-Анджелес, LA (D1) обладают ферментативной активностью от нормальной до сверхнормальной.

Для определения активности ферментов ГАЛК и ГАЛЭ диагностические тест-системы не зарегистрированы, их измерение возможно в условиях научно-диагностических лабораторий.

В случае крайне высоких значений галактозы не следует дожидаться ретеста или подтверждающей диагностики и сразу отменить молочные продукты (см. раздел "Лечение")

- Рекомендуется определение мутаций в гене GALT в крови/сухом пятне крови методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени и/или определение вариантов генов в образце биологического материала другом или неуточненном, неклассифицированные в других рубриках, методом секвенирования по Сенгеру (поиск патогенных вариантов в генах GALT, GALK1, GALE) всем пациентам со сниженной активностью фермента и/или с высоким уровнем галактозы с целью молекулярно-генетического подтверждения диагноза ГАЛ [7, 15].

Уровень убедительности рекомендаций - C (уровень достоверности доказательств - 5)

Комментарий: подтверждающая ДНК-диагностика классической ГАЛ включает два этапа: 1) скрининг на наиболее частые мутации в гене GALT и вариант Дуарте; 2) полный анализ гена методом прямого автоматического секвенирования для выявления более редких мутаций. На первом этапе наиболее целесообразно проведение поиска следующих мутаций в гене GALT: р.Gln188Arg, p.Lys285Asn, IVS3-2a->c, p.Met142Lys, p.Leu358Pro, составляющие в совокупности 82,1% мутантных аллелей в российской популяции, и p.Asn314Asp (N314D, вариант Дуарте). Алгоритм диагностики ГАЛ I представлен в Приложении Г1.

При наличии у ребенка клинических проявлений ГАЛ I с высоким уровнем галактозы в крови и нормальной активностью фермента ГАЛТ проводится поиск мутаций в гене GALE, кодирующем фермент уридиндифосфат-галактозо-4-эпимеразу (ГАЛЭ), для исключения галактоземии III типа и гена GALK, для исключения ГАЛ II.

- Рекомендуется всем пациентам с подозрением на галактоземию и в процессе динамического наблюдения проводить общий (клинический) анализ крови развернутый с целью контроля показателей [1, 7, 31, 32, 33].

Уровень убедительности рекомендаций - C (уровень достоверности доказательств - 5)

Комментарии: несмотря на отсутствие специфических изменений, Общий (клинический) анализ крови развернутый проводится пациентам с галактоземией при диагностике и в процессе динамического наблюдения в связи с повышенной частотой инфекционных осложнений. Частота контроля в динамике определяется индивидуально, не реже 1 раза в год.

- Рекомендуется всем пациентам с клинической картиной галактоземии общий (клинический) анализ мочи, исследование уровня кальция в моче, исследование уровня натрия в моче, исследование уровня цитратов, оксалатов в моче, определение концентрации водородных ионов (pH) мочи, определение удельного веса (относительной плотности) мочи с целью оценки функционального состояния почек и своевременной диагностики формирования конкрементов [30, 31, 48].

Уровень убедительности рекомендаций - C (уровень достоверности доказательств - 4)

Комментарии: у ряда пациентов, получающих диетотерапию смесями на основе сои, наблюдается нарушение работы почек, повышение содержания солей оксалатов в моче.

- Рекомендуется всем пациентам с клиническими проявлениями ГАЛ для оценки функционального состояния внутренних органов и нутритивного статуса пациента анализ крови биохимический общетерапевтический при первичной диагностике и в процессе динамического наблюдения [6, 7, 15, 29 - 35].

Уровень убедительности рекомендаций - C (уровень достоверности доказательств - 5)

Комментарии: необходимые показатели биохимического анализа крови: исследование уровня глюкозы, общего белка, белковых фракций (исследование уровня альбумина в крови, определение альбумин/глобулинового отношения), общего, свободного и связанного билирубина креатинина, мочевины, кальция общего и ионизированного, натрия, калия, неорганического фосфора, ферритина в крови, определение активности аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, щелочной фосфатазы, гамма-глутамилтранспептидазы в крови.

В связи с тем, что при поражении печени нарушается обмен липидов проводятся также исследования уровней холестерина, триглицеридов, холестерина липопротеидов низкой и высокой плотности (исследование уровня липопротеинов в крови) [50].

- Рекомендуется контроль коагулограммы (ориентировочного исследование системы гемостаза) пациентам с клиническими проявлениями ГАЛ для оценки функционального состояния печени и свертывающей системы крови [6, 15, 29].

Уровень убедительности рекомендаций - C (уровень достоверности доказательств - 5)

Комментарии: необходимые показатели коагулограммы: АЧТВ, МНО, протромбиновое время, фибриноген.

- Рекомендуется определение C-реактивного белка в сыворотке крови, прокальцитонина, кислотно-основного состояния и газов крови пациентам с клиническими проявлениями ГАЛ с целью диагностики септических состояний [39, 40, 41].

Уровень убедительности рекомендаций - C (уровень достоверности доказательств - 5)

Комментарии: сепсис, обусловленный E.coli является одним из частых и серьезных осложнений при галактоземии.

- Рекомендуется пациентам с клинической картиной галактоземии для дифференциальной диагностики ГАЛ определение активности альфа-1-антитрипсина в крови для исключения дефицита альфа-1-антитрипсина и для исключения заболеваний, сопровождающихся пролиферацией желчных протоков; исследование аминокислот и ацилкарнитинов в крови методом тандемной масс-спектрометрии для исключения нарушений обмена аминокислот, органических кислот и нарушений - окисления жирных кислот; исследование уровня аммиака в крови для исключения нарушений цикла мочевины [2, 41, 42, 51].

Уровень убедительности рекомендаций - C (уровень достоверности доказательств - 4)

Комментарии: к заболеваниям, с которыми необходимо проводить дифференциальную диагностику относятся:

- дефицит альфа-1-антитрипсина (для исключения определяется альфа-1-антитрипсин в крови)

- заболевания из группы нарушения цикла мочевины, цитрулинемии 2 типа и нарушения b-окисления жирных кислот и др. (для исключения определяется спектр аминокислот и ацилкарнитинов, а также уровня аммиака в крови). Следует с осторожностью относится к интерпретации результатов анализа аминокислот, поскольку повышение уровня фенилаланина, тирозина и метионина часто наблюдается при заболеваниях, сопровождающихся тяжелым поражением печени.

- тирозинемия тип 1 (для исключения проводится 03.E04.01.003.032 исследование аминокислот и ацилкарнитинов в крови методом тандемной масс-спектрометрии и/или 03.E04.01.006.032 исследование сукцинилацетона в сухом пятне крови методом тандемной масс-спектрометрии);

- врожденные нарушения синтеза желчных кислот;

- митохондриальные гепатопатии (для исключения проводится исследование кислотно-основного состояния и газов крови, уровень молочной кислоты в крови);

- пероксисомные болезни (для исключения определяются очень длинноцепочечные жирные кислоты в крови);

- TORCH инфекции и вирусные гепатиты (для исключения проводится обследование на TORCH инфекции и маркеры вирусных гепатитов);

- пороки и/или аномалии развития желчной системы (для исключения проводится УЗИ желчного пузыря натощак и других органов брюшной полости);

- врожденные аномалии портальной системы (для исключения проводится доплерография портальной системы);

- наследственные заболевания, проявляющиеся холестазом (для исключения проводят молекулярно-генетическое исследование по генетическим панелям).

Выбор исследований и их объем определяется клинической ситуацией в индивидуальном порядке.