Внимание! Изменения, внесенные Решением Коллегии ЕЭК от 25.06.2024 N 75, в части дополнения общими фармакопейными статьями, вводятся в действие с 1 января 2025 года.
Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 11.08.2020 N 100 (ред. от 25.06.2024) "О Фармакопее Евразийского экономического союза"

2.3.1. Отщепление гликанов

Выбор метода отщепления гликанов зависит от природы гликопротеина. Выбор реактива, применяемого для отщепления, зависит от выбора типа отщепления и от объема той информации, которая должна быть получена в результате испытания: может применяться ферментативное или химическое отщепление. В таблице 2.1.2.56.-1 представлен неполный перечень реактивов ферментативного отщепления и их субстратная специфичность.

Таблица 2.1.2.56.-1. - Перечень реактивов ферментативного отщепления и их субстратная специфичность

Реактивы

Специфичность

Отщепление N-связанных гликанов

Пептид-N4-(N-ацетил-Рисунок 354-глюкозаминил)аспарагинамидаза (КФ <*> 3.5.1.52)

Гидролиз N4-(ацетил-Рисунок 355-D-глюкозаминил)аспарагиновых остатков, в которых остаток глюкозамина может быть далее гликозилирован, с получением (замещенного) N-ацетил-Рисунок 356-D-глюкозаминиламина и пептида, содержащего остаток аспартата

- Пептид-N-гликозидаза F (PNGase F)

Отщепляет цепь у N-связанного гликана, но не отщепляет цепь N-связанного гликана, в которой присутствует ядро фукозы, связанное по положению Рисунок 357

- Пептид-N-гликозидаза A (PNGase A)

Отщепляет цепь у N-связанного гликана, в которой присутствует ядро фукозы, связанное по положению Рисунок 358

Маннозил-гликопротеинэндо-Рисунок 359-N-ацетилглюкозаминидаза (КФ <*> 3.2.1.96)

Эндогидролизует блок N, N'-диацетилхитобиозил в гликопептидах и (или) гликопротеинах с высоким содержанием маннозы, содержащих [Man(GlcNAc)2]Asn

- Эндо-Рисунок 360-N-ацетилглюкозаминидаза F (эндо F)

Отщепление гибридных и комплексных олигосахаридов с высоким содержанием маннозы

- Эндо-Рисунок 361-N-ацетилглюкозаминидаза H (эндо H)

Отщепление гибридных олигосахаридов с высоким содержанием маннозы

Отщепление O-связанных гликанов

Гликопептид Рисунок 362-N-ацетилгалактозаминидаза (КФ <*> 3.2.1.97) <**>

Гидролизует терминальные участки

D-галактозил-N-ацетил-Рисунок 363-D-галактозамина

--------------------------------

<*> Код фермента в соответствии с классификацией Международного союза по биохимии и молекулярной биологии (IUBMB).

<**> Данный фермент используется редко из-за своей высокой специфичности к субстрату.

Обычно эффективность расщепления зависит от доступности гликанов в гликопротеине. Следовательно, для увеличения доступности мест гликозилирования белок может быть денатурирован, за исключением случаев, когда необходимо профилировать гликаны по их положению в структуре молекулы (на поверхности или погружены в структуру молекулы протеина).

Для отщепления гликанов могут быть использованы химические реактивы, например, для отщепления по типу Рисунок 364 используют гидразин или борогидриды щелочных металлов.

2.3. Анализ отщепленных гликанов 2.3.2. Анализ гликанов