Методы лабораторных исследований

5.1. Лабораторные исследования, применяемые с целью этиологической диагностики (идентификации возбудителя ВП) включают: получение чистой культуры микроорганизма (бактерии или вируса), обнаружение фрагмента его генома методами амплификации нуклеиновых кислот (далее - МАНК) или АГ (полисахаридов или протеинов, расположенных на поверхности микроорганизма) в тканях и биологических жидкостях больного иммунохимическими методами (иммунохроматографический анализ (далее - ИХА), иммунофлюоресцентный метод (далее - РИФ), иммуноферментный анализ (далее - ИФА), а также обнаружение антител (далее - АТ), специфичных к АГ микроорганизма, образующихся в крови больного в ответ на инфекцию, методом иммуноферментного анализа.

5.1.1. Спектр методов лабораторной диагностики ВП может различаться в зависимости от возраста пациента, тяжести заболевания, наличия выраженной иммуносупрессии, наличия осложнений, эпидемических показаний (контакт с больным в очаге инфекции или инфицированными объектами среды) и эпидемической ситуации в мире, стране, регионе.

При тяжелых пневмониях у взрослых в дополнение к бактериологическому посеву респираторных образцов и гемокультуры проводят исследования на пневмококк с использованием экспресс-тестов для определения АГ S. pneumoniae и L. pneumophila 1 серогруппы в моче, а также исследование респираторного образца на грипп с использованием быстрых тестов и (или) МАНК (во время эпидемии в регионе, наличии клинических и/или эпидемиологических данных, свидетельствующих о вероятном инфицировании вирусом гриппа).

МАНК используются для выявления некультивируемых/трудно культивируемых бактериальных возбудителей ВП.

При тяжелой пневмонии у детей и взрослых в дополнение к бактериологическому посеву применяют экспресс-тест для обнаружения АГ S. pyogenes в материале из дыхательных путей.

Вирусная и вирусно-бактериальная инфекция часто является причиной ВП у детей младшего возраста и лиц старше 65 лет, в связи с чем в алгоритм их обследования необходимо включать МАНК, обнаруживающие широкий спектр респираторных вирусов в материале из дыхательных путей.

У детей и молодых взрослых при ВП, протекающих в нетяжелой клинической форме, проводят исследования МАНК материала из дыхательных путей для исключения микоплазменной или хламидийной этиологии ВП. Целесообразность выполнения исследований, направленных на выявление M. pneumoniae и C. pneumoniae, определяется клиническими показаниями для конкретного пациента и/или эпидемиологической обстановкой в регионе. Предпочтительно исследовать клинический материал из нижних дыхательных путей (мокрота, аспираты), при невозможности их получения - исследуется объединенный мазок со слизистой оболочки носоглотки и задней стенки глотки.

Во время подъема заболеваемости гриппом и ОРВИ, когда высока вероятность тяжелых пневмоний вирусной или вирусно-бактериальной природы у взрослых, дополнительно проводят определение вирусной этиологии и использованием МАНК и экспресс-тестов, обнаруживающих АГ вирусов гриппа и SARS-CoV-2 в материале из дыхательных путей.

5.1.1.1. Для выделения и идентификации чистой культуры бактериального патогена проводится бактериологический посев биологического материала (венозной крови или содержимого нижних дыхательных путей: мокрота, аспираты из трахеи или из зева, БАЛ) с дальнейшей биохимической идентификацией возбудителя и определение его чувствительности к антибиотикам.

Бактериологическое исследование венозной крови эффективно при подозрении на сепсис (в этом случае микроорганизм присутствует в крови в достаточной концентрации). Образцы крови берут непосредственно во флаконы с питательной средой.

Перед бактериальным посевом мокроты проводится ее исследование с помощью микроскопии под увеличением x1000 при использовании иммерсионного объектива. Микроскопия (бактериоскопия) окрашенного по Граму мазка мокроты позволяет определить доминирующий морфотип (при оценке морфологии микрофлоры), получить представление о количестве микрофлоры и определить пригодность образца мокроты для бактериологического посева. Критерием пригодности образца мокроты служит наличие более 25 сегментоядерных лейкоцитов и не более 10 эпителиальных клеток в поле зрения при просмотре не менее 20 полей зрения мазка, окрашенного по Граму (под увеличением x100).

Исследование плевральной жидкости предусматривает бактериоскопию мазка, окрашенного по Граму, с последующим культуральным исследованием.

С целью ускоренного выявления пневмококка непосредственно с чашки первичного посева применяется метод латекс-агглютинации, основанный на выявлении пневмококковых капсульных полисахаридных АГ с применением поливалентной специфической пневмококковой сыворотки.

Идентификация вида бактерии основана на определении питательных потребностей и результатах биохимических тестов. Для идентификации бактерий разработаны коммерческие биохимические панели и наборы реагентов, могут использоваться автоматизированные микробиологические анализаторы, которые уменьшают трудоемкость культурального исследования. При посеве респираторных образов (например, мокрота, БАЛ, материал, полученный с помощью защищенных щеток) рекомендуется использовать количественные или полуколичественные методы.

При интерпретации результатов бактериологического исследования респираторных образцов наряду с видовой принадлежностью клиническая значимость выделенных возбудителей оценивается с учетом степени обсеменения. Клинически значимыми при остром воспалительном процессе считаются микроорганизмы, выделенные мокроты в количестве 10⁵ КОЕ/мл, из БАЛ - 10⁴ КОЕ/мл, из биоптата, полученного с помощью защищенных щеток - 10³ КОЕ/мл.

Бактериологический посев в рутинной практике эффективен для возбудителей пневмонии, характеризующихся хорошим ростом на питательных средах.

К труднокультивируемым бактериям относятся: Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, L. Pneumophila.

Имеются сложности в выявлении случаев пневмонии, вызванной Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, отмечается низкая доля выявления случаев пневмонии, вызванной Streptococcus pneumoniae с применением бактериологического исследования. По данным формы N 2 федерального статистического наблюдения в 2022 г. удельный вес вирусных пневмоний составил 15,32% от общего количества зарегистрированных случаев внебольничных пневмоний, бактериальных пневмоний - 12,30%, а пневмококковых - 0,82%.

Результативность бактериологического (культурального) исследования зависит от соблюдения правил сбора, сроков и условий хранения биологического материала. Вероятность выявления клинически значимых бактериальных возбудителей значительно снижается при сборе клинических образцов на фоне антибиотикотерапии.

5.1.1.2. Культуры вирусов (гриппа, SARS-CoV-2 и некоторых других) выделяют при проведении эпидемиологического надзора в целях изучения их антигенных свойств, чувствительности к антивирусным препаратам, патогенности и других характеристик.

5.1.3.3. МАНК эффективно применяют для этиологической диагностики ВП, вызванных некультивируемыми/трудно культивируемыми бактериальными возбудителями, вирусами и грибами.

В эпидемиологическом надзоре за ВП МАНК используют:

- для индикации и идентификации возбудителей ВП и их количественной оценки в биологическом материале, взятом от человека;

- для ускоренной идентификации возбудителей ВП по таксономическому положению (например, вид, подвид, биовар, серогруппа), эпидемической значимости, вирулентности, антибиотикорезистентности;

- для расширенной идентификации и определения молекулярного профиля штаммов возбудителей ВП;

- для изучения вариабельности геномов штаммов возбудителей ВП при изучении путей их эволюции, персистенции возбудителя в объектах окружающей среды и макроорганизме.

Для диагностики ВП, вызванных условно-патогенными бактериями (например, S. pneumoniae, H. influenzae, S.aureus, S.pyogenes), в связи с их возможным носительством в верхних дыхательных путях, эффективны количественные тесты на основе МАНК, поскольку при исследовании материала из дыхательных путей позволяют дифференцировать случаи носительства.

5.1.1.4. Для выявления в мазках из респираторного тракта АГ вирусов гриппа, возбудителей ОРВИ, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae используется ИХА и РИФ, твердофазный ИФА.

Такие "быстрые тесты" удобно использовать для быстрого массового скрининга, но их усредненная диагностическая чувствительность составляет 60% в сравнении с культуральным исследованием и МАНК. Быстрые тесты эффективны в первые двое суток после появления симптомов респираторной инфекции, когда наиболее высока концентрация возбудителя в исследуемом респираторном образце.

Для обнаружения АГ пневмококка, гемофильной палочки и ряда других бактериальных патогенов в стерильных видах клинического материала (кровь, спинномозговая жидкость) применяют латекс-агглютинацию. Для исследования материала из нестерильных локусов (например, мокрота, БАЛ) метод не предназначен.

5.1.1.5. Обнаружение специфических АТ в сыворотках больных методами ИФА, РТГА, РСК предназначено для ретроспективного подтверждения диагноза при инфицировании Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae, L. Pneumophila, Coxiella burnetii и респираторными вирусами.

Ограничением такого способа диагностики является необходимость подтверждения появления специфических АТ (сероконверсии) 4-кратным нарастанием титра специфических АТ класса G в образцах сыворотки крови, полученных последовательно в острый период заболевания и в период реконвалесценции (спустя 10 дней - 1 месяц).

Определение АТ IgM в парных сыворотках крови считается более ценным с клинической точки зрения, поскольку они появляются в ранние сроки инфицирования и могут служить маркером недавно перенесенной инфекции.

Достоверность результата увеличивается в случае проведения исследования в обеих сыворотках одновременно.

5.1.1.6. Секвенирование нуклеиновых кислот проводится с целью определения нуклеотидного состава (последовательности) ДНК и (или) рибонуклеиновой кислоты (далее - РНК).

Секвенирование может проводиться с использованием различных технологий (платформ) секвенирования:

- первого поколения, например, секвенирование по Сэнгеру;

- второго поколения NGS (англ. new generation sequencing), например, пиросеквенирование, секвенирование путем синтеза с обратимым терминированием, секвенирование на основе лигирования, ион полупроводниковое секвенирование;

- третьего поколения NNGS (англ. Next-Next Generation Sequencing), например, нанопоровое секвенирование, одномолекулярное секвенирование в реальном времени.