"МР 3.1.0272-22. 3.1. Профилактика инфекционных болезней. Молекулярно-генетический мониторинг штаммов возбудителя новой коронавирусной инфекции. Методические рекомендации" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 10.01.2022) (вместе с...

1. Алгоритм дифференциации генетических вариантов вируса SARS-CoV-2 с помощью фрагментного секвенирования по Сэнгеру отдельных локусов гена, кодирующего S-белок

1. Алгоритм дифференциации генетических вариантов вируса SARS-CoV-2 с помощью фрагментного секвенирования по Сэнгеру отдельных локусов гена, кодирующего S-белок.

Дифференциацию геновариантов вируса SARS-CoV-2 по локусам из протоколов Университета Женевы и ARTIC осуществляют в соответствии с таблицей 2, определяя делеции 21765-21770 (делеция HV 69-70), 21991-21993 (делеция Y144), 22287-22295 (делеция LAL 242-244), 21969-21995 (делеция CNDPFLGNY 136-144), замены A21801C (замена D80A), G21974T (замена D138Y), G22132T (замена R190S), A22206G (замена D215G), A22296C (замена H245P), T22917G (замена L452R), C22995A (замена T478K), G23012A (замена E484K), G23012C (замена E484Q), A23063T (замена N501Y), C23271A (замена A570D). Нумерация нуклеотидных остатков приведена относительно референс-штамма hCoV-19/Wuhan/WIV04/2019 (EPI_ISL_402124).

На идентификацию геноварианта B.1.1.7 ("Британский") направлено обнаружение при секвенировании фрагмента F44-R44 или nCoV-2019_72 делеций 21765-21770 (HIV 69-70), 21991-21993 (Y144), а также обнаружение замены A23063T (N501Y) при секвенировании фрагмента F47-R47 или nCoV-2019_76, замены C23271A (A570D) при секвенировании фрагмента F47-R47 или nCoV-2019_77.

На идентификацию геноварианата B.1.351 ("ЮАР") направлено обнаружение при секвенировании фрагмента F44-R44 или nCoV-2019_72 замены A21801C (D80A), а также обнаружение делеции 22287-22295 (LAL 242-244) и замены A22206G (D215G) при секвенировании фрагмента nCoV-2019_73, замен G23012A (E484K) и A23063T (N501Y) при секвенировании фрагмента F47-R47 или nCoV-2019_76.

На идентификацию геноварианата -P.1 линии B.1.1.28 ("Бразильский") направлено обнаружение при секвенировании фрагмента F44-R44 или nCoV-2019_72, замены G21974T (D138Y), а также обнаружение замены G22132T (R190S) при секвенировании фрагмента nCoV-2019_73, замен G23012A (E484K) и A23063T (N501Y) при секвенировании фрагмента F47-R47 или nCoV-2019_76.

На идентификацию геноварианата B.1.617.1 ("Индийский.1") направлено обнаружение при секвенировании nCoV-2019_76 замен T22917G (L452R) и G23012C (E484Q) для филогенетической линии B.1.617.1 и замен T22917G (L452R).

На идентификацию геноварианата B.1.617.2 ("Индийский.2") направлено обнаружение при секвенировании nCoV-2019_76 замен T22917G (L452R) и G23012C (E484Q) для филогенетической линии B.1.617.1 и замен T22917G (L452R), а также C22995A (T478K) для филогенетической линии B.1.617.2.

На идентификацию геноварианта B.1.1.523 направлено обнаружение при секвенировании фрагмента F44-R45 или nCoV-2019_(72_Left+73_Right) делеции 22029-22037 (EFR 156-158), замен G23012A (E484K) и t23042c (S494P) при секвенировании фрагмента F47-R47 или nCoV-2019_76.

На идентификацию геноварианта AT.1 линии B.1.1.370.1 направлено обнаружение при секвенировании фрагмента F44-R44 или nCoV-2019_72 делеции 21969-21995 (CNDPFLGNY 136-144), а также обнаружение замен A22206G (D215G), A22296C (H245P) при секвенировании фрагмента nCoV-2019_73, замены G23012A (E484K) при секвенировании фрагмента F47-R47 или nCoV-2019_76.

Таблица 2. Список мутаций генетических вариантов вируса SARS-CoV-2, детектируемых при фрагментном секвенировании

По протоколу Университета Женевы

По протоколу ARTIC v.3

Генетические варианты SARS-CoV-2

Фрагмент F44-R45, внутренний фрагмент F44-R44 <1>

Фрагмент F46-R47, внутренний фрагмент F47-R47

Фрагмент nCoV-2019_72

Фрагмент nCoV-2019_73

Фрагмент nCoV-2019_76

Фрагмент nCoV-2019_77

Делеция HIV69-70, Y144

Замены N501Y

A570D

Делеция HIV69-70, Y144

нет

Замена N501Y

Замена A570D

Alpha B.1.1.7 (Британский)

Замена D80A

Замены N501Y

E484K

Замена D80A

Делеция LAL 242-244

Замена D215G

Замены N501Y

E484K

нет

Beta B.1.351 (ЮАР)

Замена D138Y

Замены N501Y

E484K

Замена D138Y

Замена R190S

Замены N501Y

E484K

нет

Gamma P.1, B.1.1.28 (Бразилия)

Замены G142D

<2> E154K <2>

Замены L452R <3> E484Q

Замена T95I <2>

G142D

нет

Замены L452R

E484Q

нет

Kappa B.1.617.1 (Индия.1)

Делеция FR156-157 <1>

Замена R158G <1>

Замены L452R <3>

T478K <3>

нет

Делеция FR156-157 <1>

Замена R158G <1>

Замены L452R

T478K

нет

Delta B.1.617.2 (Индия.2) <1>

Делеция EFR156-158 <1>

E484K

S494P

нет

Делеция EFR156-158

E484K

S494P

нет

B.1.1.523

Делеция CNDPFLGNY 136-144

E484K <4>

Делеция CNDPFL GNY 136-144

Замена <5> D215G H245P

E484K

нет

AT.1 линии B.1.1.370.1 (северо-западный) <4>, <5>

--------------------------------

<1> Использование праймера R44 из протокола Университета Женевы и nCoV-2019_72_Right из протокола ARTIC v.3 может быть неэффективным для идентификации геноварианта B.1.617.2 (Индия.2)! (праймеры относятся к зоне делеции).

<2> Наличие данных замен и/или делеций является возможным, но не определяющим. Определяющими стоит считать замены в положениях 452, 478, 484.

<3> Идентификация данных замен возможна только при секвенировании фрагмента F46-R47.

<4> В случае геноварианта AT.1 линии B.1.1.370.1 (северо-западный) использование праймера F46 из протокола Университета Женевы может быть неэффективным!

<5> При определении геноварианта AT.1 линии B.1.1.370.1 (северо-западный) использование праймера nCoV-2019_73_Left из протокола ARTIC v.3 невозможно!

Рекомендуемые протоколы исследования с помощью фрагментного секвенирования по Сэнгеру отдельных локусов гена, кодирующего S-белок:

Для амплификации участков, содержащих нуклеотидные замены, необходимые для определения геновариантов вируса SARS-CoV-2, используют олигонуклеотидные праймеры, указанные в Протоколе Университета Женевы (Geneva, December 26th, 2020, Rue Gabrielle-Perret-Gentil 4, 1211 Geneva 14, Switzerland), см. таблицу 3.

Таблица 3. Праймеры, используемые по протоколу Университета Женевы.

Обозначение

Последовательность (5'-3')

F44

TCTCTTCTTAGTAAAGGTAGACTT

F46 <2>

CCTTCACTGTAGAAAAAGGAATC

F47

TATCAGGCCGGTAGCACAC

R45

CTAACAATAGATTCTGTTGGTTG

R44 <1>

GAATAAACTCTGAACTCACTTTCC

R47

CATATGAGTTGTTGACATGTTCAG

--------------------------------

<1> Использование праймера R44 из протокола Университета Женевы может быть неэффективным для идентификации геноварианта B.1.617.2 (Индия.2)! (праймеры попадают в зону делеции).

<2> В случае геноварианта AT.1 линии B.1.1.370.1 (северо-западный) использование праймера F46 из протокола Университета Женевы может быть неэффективным!

При исследовании проб с низкими значениями Ct 00000001.wmz 20 (высокая вирусная нагрузка) достаточно одного раунда ПЦР с праймерами F44-R44 и F47-R47, обеспечивающими образование фрагментов 570 п.н. и 565 п.н., соответственно.

При исследовании проб с высокими значениями Ct 00000002.wmz 25 (низкая вирусная нагрузка) используется гнездовая ПЦР.

Первоначально проводят амплификацию с праймерами F44-R45 и F46-R47, фланкирующими фрагменты размером 1071 п.н. и 1068 п.н., а затем осуществляют вторую ПЦР с праймерами F44-R44 и F47-R47, где в качестве исследуемой ДНК используют ампликоны, полученные в первом раунде, см. таблицу 4.

Таблица 4. Рекомендуемые условия проведения реакции амплификации при использовании Протокола Университета Женевы.

Матричный режим

1 этап

2 этап

5 этап

6 этап

95 °C - 5 мин

95 °C - 30 с

55 °C - 30 с

72 °C - 70 с

38 циклов

72 °C - 4 мин

10 °C - хранение

В качестве альтернативного способа рекомендуется использовать пары праймеров nCoV-2019_72, nCoV-2019_76 и nCoV-2019_77 из протокола ARTIC v.3 (nCoV-2019 sequencing protocol v3 (LoCost) (protocols.io), см. таблицу 5.

Таблица 5. Праймеры, используемые по протоколу ARTIC v.3.

Обозначение

Последовательность (5'-3')

nCoV-2019_72_LEFT

ACACGTGGTGTTTATTACCCTGAC

nCoV-2019_72_RIGHT

ACTCTGAACTCACTTTCCATCCAAC

nCoV-2019_73_LEFT

CAATTTTGTAATGATCCATTTTTGGGTGT

nCoV-2019_73_RIGHT

CACCAGCTGTCCAACCTGAAGA

nCoV-2019_76_LEFT

AGGGCAAACTGGAAAGATTGCT

nCoV-2019_76_RIGHT

ACACCTGTGCCTGTTAAACCAT

nCoV-2019_76_LEFT_alt3

GGGCAAACTGGAAAGATTGCTGA

nCoV-2019_76_RIGHT_alt0

ACCTGTGCCTGTTAAACCATTGA

nCoV-2019_77_LEFT

CCAGCAACTGTTTGTGGACCTA

Рекомендуемые условия проведения реакции амплификации при использовании Протокола ARTIC v.3 см. таблица 6.

Таблица 6. Рекомендуемые условия проведения реакции амплификации при использовании протокола ARTIC v.3

Матричный режим

1 этап

3 этап

4 этап

5 этап

6 этап

95 °C - 5 мин

95 °C - 60 с

62 °C - 60 с

72 °C - 60 с

10 циклов

95 °C - 30 с

60 °C - 30 с

72 °C - 30 с

30 циклов

72 °C - 5 мин

10 °C - хранение

Допустимо также использовать праймеры из иных протоколов, позволяющие проводить амплификацию и последующее фрагментное секвенирование участков генома SARS-CoV-2, содержащих перечисленные нуклеотидные замены.

В качестве замены праймерам R44 из протокола Университета Женевы и nCoV-2019_72_Right из протокола ARTIC v.3 может быть использован праймер CACV_51_R, праймеру F46 из протокола Университета Женевы - праймер CACV_55_F и праймеру nCoV-2019_73_Left из протокола ARTIC v.3 - праймер CACV_52_F (таблица 7).

Таблица 7. Праймеры, рекомендуемые для замены неработающих праймеров из протоколов Университета Женевы и протокола ARTIC v.3

Название

Последовательность 5'-3'

Длина, пн

CACV_51_R

GAG GGA GAT CAC GCA CTA AA

20

CACV_55_F

ATG GAA CCA TTA CAG ATG CTG TAG

24

CACV_52_F

TGG ATG GAA AGT GAG TTC AGA G

22

Приложение 4. Перечень идентифицируемых генетических вариантов SARS-CoV-2 2. Алгоритм дифференциации генетических вариантов вируса SARS-CoV-2 с помощью фрагментного секвенирования полной последовательности гена, кодирующего S-белок